炮制方法对中药狗脊3种成分的影响Δ

2015-03-10赵敏杰鞠成国林桂梅贾天柱辽宁中医药大学药学院辽宁大连116600国家中医药管理局中药炮制原理解析重点研究室辽宁大连116600辽宁省中药炮制工程技术研究中心辽宁大连116600

中国药房 2015年19期

赵敏杰，鞠成国，林桂梅，张凡，贾天柱#（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600；2.国家中医药管理局中药炮制原理解析重点研究室，辽宁大连 116600；3.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连 116600）

狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz的干燥根茎，味苦、甘、性温，归肝、肾经，具有祛风湿、补肝肾、强腰膝的功效[1]。生狗脊以祛风湿、利关节为主；砂烫狗脊质地疏松，便于粉碎和煎出有效成分，且易于除去残存绒毛；蒸狗脊和酒狗脊、盐狗脊具有增强“补肝肾、强腰膝”的作用[2]。本课题组前期对狗脊不同炮制品的药效学作了大量的研究[3-7]，但尚未涉及这5种样品水煎液中化学成分含量的变化情况。因此，本试验同时对狗脊生品及其4种不同炮制品水煎液中水溶性总蛋白、总酚酸、总多糖的含量进行比较研究，以期阐明炮制对狗脊化学成分的影响，为临床合理用药提供依据。

1 材料

1.1 仪器

U-3010型紫外-可见分光光度计（日本日立公司）；电热恒温水浴锅、101型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗器械有限公司）；AE240型十万分之一分析天平（瑞士梅特勒公司）；FA1004B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；HH-4型恒温水浴锅（国华电器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵（上海予华仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

D-无水葡萄糖（以下简称葡萄糖）对照品、原儿茶醛对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-200904、118010-201007，纯度：＞98%）；牛血清白蛋白（北京索莱宝科技有限公司，批号：711J053，纯度：＞98%）；考马斯亮蓝G250（以下简称考马斯亮蓝，天津市大茂化学试剂厂）；苯酚、浓硫酸、乙醇、丙酮、乙醚均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

狗脊于2013年11月采自广西河池，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz的根茎。

2 方法与结果

2.1 4种炮制品的制备

2.1.1 砂烫狗脊的制备取净河砂400 g，置于炒制容器内，用武火加热至180～190 ℃呈滑利状态时，加入净狗脊片50 g，不断翻炒，6 min后取出[8]。

2.1.2 盐狗脊的制备取净狗脊片50 g，加入含盐量为1 g的盐水40 ml，用保鲜膜密封，浸润2 h，武火蒸制3 h，停火闷润4 h，取出干燥[9]。

2.1.3 酒狗脊的制备取7.5 g黄酒，用清水稀释至40 ml，加入50 g净狗脊片中拌匀，用保鲜膜密封，浸润2 h，放入锅内武火蒸制4 h，停火后闷润4 h，取出干燥[10]。

2.1.4 蒸狗脊的制备取净狗脊片50 g，加入清水40 ml并用保鲜膜密封，浸润1 h，放入锅内武火蒸制4 h，停火闷润4 h，取出干燥[11]。

将生品及以上4种炮制品粉碎，过三号筛，备用。

2.2 水溶性总蛋白的含量测定[12]

2.2.1 考马斯亮蓝溶液的制备精密称取考马斯亮蓝100 mg，加入95%乙醇50 ml，溶液变为蓝色，再加入85%（W/V）磷酸溶液100 ml，此时溶液变成血红色，最后用蒸馏水定容至1 000 ml，混匀。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取牛血清白蛋白0.010 05 g，用少量蒸馏水溶解，定容至100 ml，即得100.5 μg/ml的蛋白质标准贮备液（4 ℃冰箱中保存）。

2.2.3 供试品溶液的制备精密称取狗脊生品及不同炮制品粉末各1 g，置于圆底烧瓶中，精密加入蒸馏水100 ml，称质量，加热回流2 h，放凉后补足质量。

2.2.4 标准曲线的制备取牛血清蛋白标准贮备液100、200、300、400、500、600、800 μl，分别补加蒸馏水至1 ml，再分别加入5 ml考马斯亮蓝溶液，显色5 min。以1 ml蒸馏水作空白，在400～800 nm波长处扫描，结果牛血清白蛋白在590 nm波长处有最大吸收。测定上述溶液在590 nm波长处的吸光度。以牛血清白蛋白质量浓度（x，μg/ml）为横坐标，以吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝0.007 6x+0.081 5（r＝0.999 9）。结果表明，牛血清白蛋白检测质量浓度线性范围为10.05～80.40 μg/ml。

2.2.5 精密度试验取牛血清白蛋白标准贮备溶液1 ml，按“2.2.4”项下操作，连续测定6次。结果，吸光度的RSD＝0.56%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.6 显色稳定性试验取生狗脊供试品溶液，按“2.2.4”项下相关方法操作，每隔5 min测定1次吸光度，连续测定30 min。结果，吸光度的RSD＝3.23%（n＝7），表明供试品溶液中总蛋白在30 min内显色基本稳定。

2.2.7 重复性试验取生狗脊粉末6份，按“2.2.3”项下方法制备，按“2.2.4”项下方法测定其含量。结果，含量的RSD＝1.65%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验称取已知含量的生狗脊粉末0.5 g，共6份，精密称定，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，分别加入牛血清蛋白20.15 mg，然后按“2.2.4”项下方法测定含量，计算得总蛋白的平均回收率为101.1%（RSD＝3.52%，n＝6）。

2.3 总酚酸的含量测定[13]

2.3.1 对照品溶液的制备精密称取原儿茶醛对照品5.31 mg，置于50 ml量瓶中，加水使充分溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.106 2 mg/ml的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备精密称取狗脊生品及不同炮制品粉末各0.1 g，置于圆底烧瓶中，精密加入蒸馏水100 ml，称质量，加热回流2 h，放凉后补足质量。

2.3.3 标准曲线的制备精密吸取原儿茶醛对照品溶液50、100、200、300、400、500、600 μl，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇至2 ml，加0.3%十二烷基硫酸钠0.8 ml、0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）6]（1 ∶1）混合溶液0.4 ml，混匀，暗处放置5 min，加0.1 mol/L盐酸溶液至25 ml，摇匀，暗处放置20 min。蒸馏水平行做空白试验。以原儿茶醛对照品溶液质量浓度（x，mg/ml）为横坐标，以760 nm波长处测定的吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝35 366x+0.175 7（r＝0.999 5）。结果表明，原儿茶醛检测质量浓度线性范围为5.31～63.72 μg/ml。

2.3.4 精密度试验取原儿茶醛对照品溶液0.5 ml，按“2.3.3”项下方法操作，连续测定6次。结果，吸光度的RSD＝0.45%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.5 显色稳定性试验取生狗脊供试品溶液，按“2.3.3”项下操作，每隔5 min测定1次吸光度，连续测定30 min。结果，吸光度的RSD＝4.36%（n＝7），表明狗脊供试品溶液中总酚酸类化合物在30 min内显色基本稳定。

2.3.6 重复性试验取生狗脊粉末6份，按“2.3.2”项下方法制备，按“2.3.3”项下方法测定其含量。结果，含量的RSD＝2.26%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验称取已知含量的生狗脊粉末0.1 g，共6份，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别加入原儿茶醛对照品0.25 mg，按“2.3.3”项下方法测定含量，计算得总酚酸的平均回收率为99.6%（RSD＝2.97%，n＝6）。

2.4 总多糖的含量测定[14]

2.4.1 对照品溶液的制备取105 ℃干燥至恒质量的葡萄糖约100 mg，精密称定，置于100 ml量瓶中，加入适量水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得1.021 0 g/L的葡萄糖对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备取狗脊生品及不同炮制品粉末各0.5 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入100 ml 80%乙醇，加热回流，每次1 h，至无色，抽滤。滤渣在常温下挥干，将滤渣连同滤纸置于圆底烧瓶中，加蒸馏水100 ml，加热回流1 h，2次，趁热滤过，用少量水洗涤滤器，合并滤液和洗液，放冷，移入250 ml量瓶中，稀释至刻度，即得。

2.4.3 苯酚试液的制备取苯酚100 g，加铝片0.1 g、碳酸氢钠0.05 g，蒸馏，182 ℃收集馏分。称取该馏分5 g，置于100 ml量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，滤过并置于棕色瓶中，即得5%苯酚试液，备用。

2.4.4 标准曲线的制备精密吸取葡萄糖对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，分别置于具塞刻度试管中，加水至1 ml，再分别加入5%苯酚溶液1 ml，混匀，加入浓硫酸5 ml，充分混匀。另取1.0 ml的蒸馏水同上操作，作为空白对照。将上述溶液置于沸水浴中反应5 min，迅速放冷至室温，在489 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖对照品溶液质量浓度（x）为横坐标，以吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝7 642.088x+0.154（r＝0.999 3）。结果表明，葡萄糖检测质量浓度线性范围为0.051 1～0.613 mg/ml。

2.4.5 精密度试验取同一供试品溶液1.0 ml，按“2.4.4”项下方法，连续测定6次。结果，吸光度的RSD＝1.03%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.6 显色稳定性试验取生狗脊供试品溶液，按“2.4.4”项下方法操作，每隔5 min测定1次吸光度，连续测定30 min。结果，吸光度的RSD＝2.67%（n＝7），表明供试品溶液中总多糖在30 min内显色基本稳定。

2.4.7 重复性试验取生狗脊粉末6份，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.4”项下方法测定，结果总多糖的平均含量为28.56%（RSD＝1.41%，n＝6），表明方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验称取已知含量的生狗脊粉末0.25 g，共6份，精密称定，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，分别加入葡萄糖对照品71.4 mg，然后按“2.4.4”项下方法测定含量，计算得总多糖的平均回收率为99.3%（RSD＝3.56%，n＝6）。

2.5 含量测定结果

取狗脊生品及不同炮制品分别按照“2.2.3”“2.3.2”“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，再分别按“2.2.4”“2.3.3”“2.4.4”项下方法测定吸光度，计算供试品中水溶性总蛋白、总酚酸和总多糖的含量，结果见表1。

表1 狗脊生品及其不同炮制品中水溶性总蛋白、总酚酸、总多糖含量测定结果（n＝6，%）Tab 1 Determination results of water-soluble total protein，total phenolic acid and total polysaccharides in crude C.barometz and different processed products（n＝6，%）

由表1结果可知，不同的炮制方法对狗脊中水溶性总蛋白、总酚酸、总多糖含量均有一定的影响，水溶性总蛋白的含量在炮制后均呈现一定程度的降低，总酚酸和总多糖的含量在炮制后均呈现一定程度的升高。

3 讨论

本试验首次考察了狗脊不同炮制品水煎液中水溶性总蛋白、总酚酸、总多糖的含量变化。炮制后水溶性总蛋白的含量均较生品有所下降，可能是由于加热破坏了狗脊中的部分蛋白质结构，从而使其含量有所下降，但是含量降低后所致生物活性的变化尚不明确，有待进一步研究。酚酸类化合物是狗脊中重要的活性成分，《中国药典》以原儿茶酸作为含量测定的指标来评价药材的质量。狗脊中总酚酸的含量炮制后均有所增加，是由于炮制加热致使糖苷键断裂生成酚酸所致，故炮制后“补肝肾、强腰膝”作用的增强可能与总酚酸的含量增加有关[15]。多糖是中药中普遍存在的一类化学成分，具有延缓衰老、提高免疫功能等多方面的补益药理作用[16-18]，狗脊经炮制后多糖含量的增加也符合制狗脊“补肝肾作用增强”的传统炮制理论。但是狗脊发挥药效的活性成分尚不能明确，故还有待进一步研究。

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