HPLC法同时测定三黄滴丸中5种蒽醌类成分的含量

2015-03-09魏艳婷张静宜张华潭李春花河北医科大学研究生学院石家庄050017河北中医学院药学院石家庄050091

中国药房 2015年27期

魏艳婷，张静宜，张华潭，李春花（1.河北医科大学研究生学院，石家庄 050017；2.河北中医学院药学院，石家庄 050091）

三黄滴丸由大黄、黄芩浸膏、盐酸小檗碱组成，是按照临床常用的非处方药三黄片组方比例进行投料，运用固体分散技术制成的中药复方制剂，具有清热解毒、泻火通便的功效。三黄滴丸较传统片剂具有溶散速度快、药物颗粒小、生物利用度高等优点。对于这一新型制剂，目前生产工艺、含量测定等的研究均较少，质量标准暂不统一。因此，本研究采用高效液相色谱（HPLC）法，同时测定了该复方制剂中5 种蒽醌类成分的含量，操作简便，结果准确，在2010 年版《中国药典》（一部）三黄片[1]的基础上提高了质量标准，现报道如下。

1 材料

LC-15C 型HPLC 仪，包括SPD-15C 紫外检测器、LCsolution色谱工作站（日本岛津公司）；1810-BC型石英自动双重高纯水蒸馏器（江苏金坛市白塔石英玻璃仪器厂）；TG328B型分析天平（上海精科分析仪器厂）；KQ-100E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；有机微孔滤膜（0.22 μm）。

三黄滴丸（河北中医学院药学院自制，批号：20130315-01、20130315-02、20130315-03）。芦荟大黄素对照品（批号：20120412，纯度≥98%）、大黄酸对照品（批号：MUST-11032801，纯度≥98%）、大黄素对照品（批号：MUST-12022715，纯度≥98%）、大黄酚对照品（批号：20120320，纯度≥98%）、大黄素甲醚对照品（批号：PF0223 SA13，纯度≥98%）均由上海源叶生物科技有限公司提供；甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水（河北中医学院药学院自制）。

2 方法与结果[2-6]

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.23%磷酸溶液（85∶15，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：440 nm；柱温：室温；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品各适量，精密称定，分别置于10 ml量瓶中，加适量甲醇，超声（功率：250 W，频率：33 kHz）处理20 min，使溶解，加甲醇定容，即得对照品贮备液。取对照品贮备液各5 ml，置于同一25 ml量瓶中，制成质量浓度分别为0.035、0.323、0.065、0.075、0.037 mg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取三黄滴丸1.0 g，精密称定，置于25 ml量瓶中，加甲醇适量，超声（功率：250 W，频率：33 kHz）处理20 min，加甲醇定容，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液按处方比例和三黄滴丸的制备工艺制备缺大黄药材的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3 系统适用性试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，供试品溶液与混合对照品溶液均在相同保留时间处出现芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚吸收峰，阴性对照溶液在该处无吸收。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰与其他组分峰达到基线分离，分离度均大于1.5，阴性对照溶液在该处无吸收峰。理论板数以相应色谱峰计均不低于10 000。

图1 高效液相色谱图A.供试品；B.混合对照品；C.阴性对照；1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚Fig 1 HPLC chromatogramsA.test samples；B.mixed reference；C.negative control；1.aloeemodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液2、5、8、10、15、18、20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equation and linear ranges

2.5 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.31%、0.25%、0.27%、0.27%、0.23%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密量取同一供试品（批号：20130315-01）溶液适量，分别于放置0、6、12、18、24、36 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.91%、1.86%、1.96%、1.31%、1.17%（n＝6），表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取样品（批号：20130315-01）6 份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.70、4.69、1.24、2.03、0.75 mg/g，RSD分别为1.56%、1.53%、1.65%、1.80%，1.51%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：20130315-01）9份，每份0.1 g，分别精密加入一定量的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表2。

2.9 样品含量测定

精密称定3批样品各适量，每批2份，每份1.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，并计算样品含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 测定波长的选择

将配制的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚对照品溶液，采用紫外-可见分光光度计进行扫描，结果发现5 种蒽醌类成分在440 nm 波长左右均有较强吸收。因此，选择440 nm为本研究的检测波长。

3.2 流动相的选择

经查阅文献[7-8]，笔者曾试用甲醇-0.1%磷酸溶液（90∶10，V/V）为流动相，但芦荟大黄素与大黄酸并未得到较好分离，拖尾现象严重，考虑到加入适当磷酸可以改善色谱峰的拖尾现象，又尝试以甲醇-0.23%磷酸溶液（85∶15，V/V）为流动相，结果发现5 种蒽醌类成分均可较好的分离，且峰形较好；芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚与相邻峰分离度分别为1.568、2.890、4.723、6.106、9.995，理论板数分别在70 000、16 000、10 000、20 000、40 000以上。

3.3 含量限度的确定

测定100 粒滴丸，平均质量为50 mg/丸。本试验选取了3批滴丸进行5 种蒽醌类成分的含量测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚平均含量分别为0.703 72、4.693 09、1.241 60、2.033 54、0.749 34 mg/g，考虑到药材来源、制备过程中的损耗、储存中损失等诸多因素的影响，按平均值的80%计算[9]，暂定三黄滴丸中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的含量分别不得小于0.028 15、0.187 72、0.049 66、0.081 34、0.029 98 mg/丸。