轩辕欢，魏 敏，田红林，成 杰（.新疆医科大学附属中医医院药学部，乌鲁木齐 830004；.新疆医科大学第六附属医院药剂科，乌鲁木齐 83000；3.武警新疆总队医院药局，乌鲁木齐 83009）

余甘子为大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果实[1]，二级干、一级寒[2]，味甘、酸、涩[3]，具有清热利咽、安神补心、润肺止咳、收敛止泻、开胃进食等功效[4]，其中没食子酸为其主要有效成分[5]。目前，对于余甘子不同制备部位分离纯化的相关报道较少。为了加大余甘子药材的资源利用程度，本试验采用相关分离纯化技术制备了余甘子不同提取部位，并分析各提取部位中没食子酸的含量，以为余甘子的更深层次研究提供科学理论基础。

1 材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪，包括二级管阵列检测器（美国Agilent 公司）；721s 型紫外分光光度计（上海精科仪器有限公司）；KQ5200B 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；BS124S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 试剂

没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：11672-201304，纯度＞98%）；大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；C18硅胶（济南博纳生物技术有限公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

试验所用药材，经新疆医科大学附属中医医院药学部田红林副主任药师鉴定为真品，具体来源见表1。

表1 余甘子来源Tab 1 Origin of P.emblica

2 方法与结果

2.1 余甘子不同提取部位的制备

取余甘子药材适量，粉碎，精密称取1 g，置于250 ml量瓶中，加70%甲醇150 ml，超声（功率：70 W 频率：40 kHz，下同）处理2 h，加70%甲醇定容，静置2 h，滤过；滤液水浴60 ℃蒸干，加水溶解，用乙醚和乙酸乙酯先后萃取，萃取液过大孔树脂层析柱进行层析，以水～乙醇梯度洗脱，只留40%乙醇洗脱液和70%乙醇洗脱液（出膏率较高）；大孔树脂40%、70%分流液水浴蒸干，加水溶解，过C18层析柱层析，分别得水、50%、70%甲醇洗脱液，60 ℃蒸干，依次得70%甲醇提取物、大孔树脂40%乙醇洗脱液、大孔树脂70%乙醇洗脱液、C18水洗脱液、C1850%甲醇洗脱液、C1870%甲醇洗脱液的干燥粉末，出膏率分别为70.5%、55.6%、50.2%、7.1%、11.7%、15.9%。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：ZORBAX Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（10∶90，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。在上述色谱条件下进样测定，结果各成分理论板数均大于5 000，分离度均大于1.5，各成分基线分离良好，详见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.对照药材；C.70%甲醇提取部位；D.大孔树脂40%乙醇洗脱液；E.C18水洗脱液；F.大孔树脂70%乙醇洗脱液；G.C1850%甲醇洗脱液；H.C1870%甲醇洗脱液；1.没食子酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.reference crube herbs；C.methanol 70% extracts；D.macroporous resin 40% ethanol elutent；E.C18water elution；F.macroporous resin 70% ethanol eluent；G.C1850% methanol eluent；H.methanol C1870%eluent；1.gallic acid

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品适量，置于25 ml 量瓶中，加水溶解并定容，制成质量浓度为0.425 0 mg/ml的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取药材粉末0.1 g，精密称定，置于250 ml量瓶中，加水150 ml，放置过夜，超声处理10 min，放冷，用水定容，摇匀，静置，滤过；弃去初滤液50 ml，精密量取续滤液20 ml，置于100 ml棕色量瓶中，用水定容，摇匀，即得[1]。

2.2.4 不同提取部位供试品溶液的制备 分别精密称取70%甲醇提取物、大孔树脂40%乙醇洗脱液、大孔树脂70%乙醇洗脱液、C18水洗脱液、C1850%甲醇洗脱液、C1870%甲醇洗脱液的干燥粉末（过2号筛）各10 mg，分别置于100 ml量瓶中，加水适量，放置过夜，超声处理10 min，放凉后加水定容，即得。

2.2.5 线性范围考察 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液1、2、3、4、5 ml，分别置于10 ml量瓶中，加流动相定容，制成系列对照品溶液。精密吸取上述系列对照品溶液各10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以没食子酸质量浓度（x，mg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝20 210x+110.1（r＝0.999 9，n＝6）。结果表明，没食子酸检测质量浓度线性范围为0.042 5～0.212 5 mg/ml。

2.2.6 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果，没食子酸峰面积的RSD为1.1%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：20140601）适量，分别于放置0、2、4、6、8 h时进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸峰面积的RSD为2.4%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.2.8 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：20140601）适量，按“2.1”项下方法制备不同提取部位，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸峰面积的RSD 为1.5%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已含量的样品（批号：20140601）适量，共6 份，按“2.1”项下方法制备不同提取部位，分别加入适量对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品含量，并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.2.10 样品含量测定 取3 批样品各适量，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝3）Tab 3 Results of contents determination of sample（n＝3）

3 讨论

余甘子中富含大量水解类鞣质、没食子酸及酚酸类化合物，本试验以用甲醇作为溶剂，所得没食子酸含量较高，并筛选了20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇的提取效果，最终选择70%甲醇为提取溶剂。

笔者首次采用大孔树脂方法应用于维吾尔药材余甘子总鞣质提取液的分离纯化，洗脱时，采用水-乙醇梯度洗脱，分别选取不同质量浓度乙醇（20%、40%、50%、60%、70%、80%、95%、100%）进行了预试验，测定出膏率，最终选择了出膏率较高的40%乙醇和70%乙醇进行没食子酸的含量测定。采用C18层析柱层析洗脱时，采用了水、甲醇30%、50%、70%、90%、100%）进行了洗脱，测定出膏率，选择了出膏率较高的水、50%甲醇、70%甲醇进行没食子酸的含量测定。

综上所述，该方法操作简便、重复性好，可用于余甘子不同制备部位中没食子酸含量的测定。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：311

[2]茹克娅·胡加阿不都拉，帕提古力·雅克甫，希尔艾力·吐尔逊，等.余甘子的维吾尔医应用及研究进展[J].中国民族医药杂志，2011，17（12）：61.

[3]王飞，包永睿，孟宪生，等.不同产地余甘子酚酸类成分HPLC指纹图谱研究[J].亚太传统医药，2014，10（4）：31.

[4]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编：下[M].北京：人民卫生出版社，1978：335.

[5]王吉文，房志坚，成金乐，等.HPLC法同时测定铁包金不同药用部位中芦丁和槲皮素的含量[J].中国药房，2014，25（43）：4 098.