魏 星 张海静 潘宝平

(天津师范大学生命科学学院 天津市动植物抗性重点实验室 天津 300387)

青蛤(Cyclina sinensis)是我国常见的海产养殖贝类,因其肉质鲜美,营养丰富,目前已成为重要的海水养殖对象之一(高晶等,2015)。但是随着近年来国内青蛤养殖业的扩大,加之水质污染严重,青蛤由病原微生物引起的疾病时有发生(曹华,2004)。其中,鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是引起海洋生物死亡的一种主要的革兰氏阴性菌,并且对青蛤有明显毒害作用(葛端阳等,2012)。由于青蛤缺乏特异性免疫系统,仅仅依赖其先天性免疫系统防御入侵的病原微生物。因此,对免疫信号通路相关分子的研究有助于更深入地了解软体动物的先天性免疫防御机制,为贝类养殖疾病防控提供新思路。

无脊椎动物为先天性免疫防御系统,也称为非特异性免疫(Iwanagaet al,2005)。非特异性免疫系统可以通过 Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)对病原相关分子模式(PAMPs)的识别,从而激活下游信号通路,最终导致入侵病原体的清除(Janewayet al,2004)。所有的 Toll样受体家族成员均依赖于 TIR(Toll/IL-1R homologous region)结构域向细胞内转导其识别的信号。一类包含 TIR结构域的接头分子如MyD88、TIRAP、TRIF、TRAM可募集到不同的Toll样受体(张炜等,2006),TLRs信号通路依据接头分子的不同可以分为 MyD88依赖型信号通路和 MyD88非依赖型信号通路(Akiret al,2004)。在TLRs 信号通路中,IκB (inhibitor of NF-κB)是一类重要的信号分子,是核转录因子 κB (Nuclear factor-κB,NF-κB)的抑制蛋白(Vallabhapurapuet al,2009)。在没有受到刺激的细胞中,NF-κB二聚体通过与IκB结合而以失活状态存在于细胞质中。当受到外界刺激后,IκB通过磷酸化和泛素化而被蛋白酶降解,活化的 NF-κB随即转位到核内与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录(Baldwin,1996)。

IκB家族成员存在三个特征结构域: 锚蛋白重复序列(ankyrin repeat,ANK),ANK是哺乳动物中与NF-κB蛋白相互作用的重要结构域; N端调控区,包含两个保守的丝氨酸残基及降解序列(degradation motif); 以及PEST结构域(PEST motif),富含脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸残基(Baldwin,1996)。在哺乳动物中 IKBs有 7种结构类型,其中 IκBa、IκBβ、IκBε这 3 种 IκB 含有 N 端调控区(郭伟等,2006)。近年来,在一些海洋双壳类软体动物中也发现了IκB基因,例如合浦珠母贝、海湾扇贝、菲律宾蛤仔、太平洋牡蛎、文蛤(Zhanget al,2009,2011; Muet al,2010; Yanget al,2011; Leeet al,2013),它们对病原微生物刺激的研究结果表明,IκB基因参与这些生物的先天免疫信号转导。

1 材料与方法

1.1 实验青蛤

青蛤采自于天津市大港滩涂,选取平均壳长(29.12±1.49)mm,平均壳高(29.86±1.57)mm,平均壳宽(19.56±0.47)mm的个体,暂养于通气海水中,水温20—23°C,海水密度 1.020—1.040 g/cm3,海水 pH 7.0,投喂5‰的小球藻,一周后进行试验。

1.2 菌种

实验室保存的鳗弧菌用2216E培养基于28°C下培养24h。

1.3 侵染实验

将培养好的鳗弧菌用无菌海水洗脱,浓度调至OD600=0.4 (1OD = 1×108bacteria/mL)。实验随机分组,每次设10个平行组。在注射前称取青蛤闭壳肌、鳃、肝脏、外套膜和性腺各 50mg,并迅速放入装有液氮的预冷研钵中按 1∶9的质量体积比加入预冷生理盐水并研磨,研磨后于4°C,4500 r/min离心15min,取上清液备用。实验组的每只青蛤注射50μL鳗弧菌菌液,空白组注射等量灭菌的生理盐水,对照组注射等量的灭菌海水。分别于注射后0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、96h提取血淋巴,并于 4°C条件下,8000 r/min离心10min,收集血细胞,加入1mL Trizol,置于–80°C超低温冰箱以备使用。

1.4 转录组文库的构建及筛选

Trizol法提取健康青蛤各个组织的总RNA,使用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits法分离纯化总RNA。纯化后的 mRNA用随机引物逆转录法合成cDNA。纯化的双链cDNA再经末端修复、加尾等步骤完成整个文库制备。采用Illumina MiSeq二代测序仪完成转录组测序。去冗余后的数据采用Unigene编码蛋白框ORF预测分析,并与NR数据库等BLAST比对分析,通过Blast2GO软件完成Unigene的GO注释。根据KEGG数据库注释并进一步对Unigene进行Pathway通路的注释和预测(Panet al,2015),从中筛选得到青蛤IκB (CsIκB)基因类似序列。

1.5 生物信息学分析

根据从转录组文库中筛选出的 CsIκB基因类似序列设计特异性引物 CsIκB-S、CsIκB-A (表 1)进行基因克隆并测序后与 GenBank核酸数据库进行BLASTX (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)分析; ORF Finder (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)预测开放阅读框(ORF); ProtParam工具在线预测序列的分子式、分子量和等电点; ExPASy (http: //web.expasy.org/compute_pi/)分析蛋白质性质; SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)查找蛋白质结构域; PEST find 用于预测 PEST结构域(http: //www.at.embnet.org/toolbox/pestfind/),Proscan (http: //pbil.ibcp.fr/)用于推断酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。使用 ClustalX1.83对氨基酸序列进行比对,根据邻接法(NJ),使用MEGA4.1构建基因系统进化树,采用 bootstrap1000个循环检验拓扑结构的置信度。

1.6 Cs IκB基因在各组织内的表达分析

表1 本研究所用PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences used in this study

参照1.3方法,将青蛤肝脏、外套膜、闭壳肌、鳃和性腺的上清液与青蛤注射后0h的血细胞分别置于1mL TRIZOL中提取总RNA,并根据TaKaRa公司的PrimerScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit使用说明反转录成cDNA,以cDNA为模板,β-actin基因为内参基因进行实时荧光定量PCR。根据β-actin基因和克隆得到的 CsIκB基因序列分别设计引物为:β-actin F、β-actin R、CsIκB-F、CsIκB-R (表 1)。反应体系为20μL,在Rotor-Gene 6000实时定量PCR仪上进行,反应程序为: 95°C 30s; 94°C 5s,60°C 30s,72°C 30s,40 个循环。采用 2-ΔΔCT法计算 Cs IκB 基因表达量(Livaket al,2001),并使用SPSS软件进行数据分析。

1.7 鳗弧菌刺激后Cs IκB基因在血淋巴内的时序性表达

分别利用1.2.1方法中鳗弧菌刺激后0h、3h、6h、12h、24h、48h、96h的血细胞提取总 RNA,并反转录成 cDNA进行实时荧光定量 PCR,方法及引物同1.6。反应程序为: 95°C 30s; 95°C 5s,58°C 30s,72°C 30s,40个循环。采用2-ΔΔCT法处理数据,使用SPSS软件对同一时间点的实验组和对照组以及实验组与空白组的表达量进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 Cs IκB基因的序列分析

从青蛤转录组文库筛选得到 CsIκB基因类似序列,设计引物克隆并测序,BLASTX进行序列比对及ORF分析后结果显示CsIκB基因cDNA序列ORF为1134bp,预测编码 377个氨基酸(图 1),分子量为41.79 kDa,等电点为 4.98,氨基酸组成中亮氨酸(Leu)含量最高,占10.6%。C端存在6个ANK。N端存在DS64GILS68序列,与保守的DSGXXS降解序列一致。利用 PEST序列查找软件分析表明,CsIκB不存在PEST结构域,但是C端存在保守的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(S373DDES377),通常位于 PEST结构域。Cs IκB基因在GenBank中的注册号为KP067202。

2.2 Cs IκB基因的系统进化分析

经GenBank BLASTX研究表明,Cs IκB基因氨基酸序列与菲律宾蛤仔 IκB(Ruditapes philippinarum,ACF93446)基因的氨基酸序列同源性最高,达到 59%,与海蜗牛(Aplysia californica,XP_005111546)、长牡蛎(Crassostrea gigas,ADX06856)、布氏新亮丽鲷(Neolamprologus brichardi,XP_006792655)、合浦珠母贝(Pinctada fucata,ACF93446)和红鲍(Haliotis rufescens,AGZ03662)IκB基因的氨基酸序列同源性为40%、40%、41%、42%和44%。利用无脊椎动物和脊椎动物代表性的 IκB氨基酸序列构建的系统进化树显示(图 2),无脊椎动物与脊椎动物的 IκB氨基酸序列出现一个明显的进化分歧。CsIκB基因与菲律宾蛤仔IκB基因聚为一支,与其它无脊椎动物IκB基因聚类。

2.3 Cs IκB基因在各组织间的表达

通过实时荧光定量PCR技术检测CsIκB基因在青蛤不同组织中的表达情况,结果显示,CsIκB基因在所检测的血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌、鳃和性腺 6种组织中均有表达,并且在血淋巴中表达量最高,其次为闭壳肌和性腺,而在肝脏中表达量最低(图3)。

2.4 Cs IκB基因在鳗弧菌刺激下的表达

青蛤在鳗弧菌侵染刺激后,在青蛤血淋巴中的CsIκB基因的时序性表达情况如图4所示,实验组的表达量在刺激后 3h迅速升高,与对照组及空白组相比均有极显著性差异(P＜0.01); 在6h时表达量达到最大值,约为对照组的 2.3倍左右,并且与对照组及空白组均差异极显著(P＜0.01)。表达量于6h后开始下降,并逐渐接近正常水平。对照组没有显著性变化。

3 讨论

本研究从青蛤转录组文库中筛选并进一步克隆得到了TLRs通路信号分子CsIκB的cDNA序列。分子系统学分析表明,CsIκB在从无脊椎动物到脊椎动物不同物种的进化上极为保守,青蛤、菲律宾蛤仔海湾扇贝等软体动物动物的 IκB聚为一类。由此推测,这些软体动物IκB蛋白有相似的生物学功能,在其先天性免疫防御中起着重要作用。CsIκB基因包含6个ANK,降解域以及保守的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。研究发现合浦珠母贝、海湾扇贝、菲律宾蛤仔、太平洋牡蛎(Zhanget al,2009,2011; Muet al,2010; Leeet al,2013)等的IκB基因也存在6个ANK,然而文蛤的IκB基因存在5个 ANK (Yanget al,2011)。ANK数量的差异可能与其相互作用的 NF-κB/Rel蛋白的不同有关。

根据前人对哺乳动物IκB基因的研究表明,降解域中丝氨酸残基的磷酸化是由多种细胞外刺激介导的(Luqueet al,2000)。特别是IKK激活IκB的降解域,导致泛素化和蛋白酶体降解(Schmidet al,2008)。CsIκB基因 N端存在保守的降解域(DS64GILS68),表明 CsIκB可能同样是由 IKK 和 NF-κB调节的。IκB基因的C端通常存在PEST结构域,会导致含有它们的细胞内蛋白的快速降解(Rogerset al,1986)。然而CsIκB 基因与一些软体动物的 IκB 基因一样缺少PEST结构域,如合浦珠母贝、海湾扇贝、太平洋牡蛎(Zhanget al,2009,2011; Muet al,2010)。但是CsIκB的 C端存在酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(S373DDES377),说明也许一些IκB基因的降解不需要PEST结构域,而是酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点起到关键作用。

图1 CsIκB基因的cDNA序列的开放阅读框及推导的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence of CsIκB ORF and its deduced amino acid sequence方框且加粗部分代表起始密码子,*代表终止密码子,下划线代表降解域,圆圈部分代表保守的丝氨酸残基,灰色底纹部分代表6个ANK,方框代表酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点

哺乳动物 IκB蛋白在不同组织的表达差异是由于它们对NF-κB二聚体的亲和力不同所致(Hoffmannet al,2006)。也是由于NF-κB参与多种生理过程,如免疫反应、炎症反应、细胞增殖和凋亡、细胞应激反应以及组织重建(Liet al,2002)。本研究通过实时定量PCR技术分析了 CsIκB基因在青蛤不同组织中的表达情况,结果显示CsIκB基因在青蛤血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌、鳃和性腺6种组织中均有表达但表达量不同,表明 NF-κB基因作为一种多效性的转录因子在各个组织中被屏蔽的程度不同。CsIκB基因在血淋巴中的表达量最高,该结果与合浦珠母贝poI-κB、菲律宾蛤仔 Rp-IκB、太平洋牡蛎 IκB1 (Zhanget al,2009,2011; Leeet al,2013)在血淋巴中的表达情况相似。血淋巴是软体动物免疫系统的重要组成成分,介导了软体动物内部防御中对于入侵病原微生物的吞噬和包埋作用(Humphrieset al,2003)。

图2 CsIκB和其它物种的IκB氨基酸序列构建的系统树Fig.2 The phylogenetic tree constructed by the amino acid sequence of CsIκB and IκBs from other species建立系统树所用的物种以及序列号为: Drosophila melanogaster (AAA85908); Haliotis diversicolor (AHM27300); Haliotis rufescens(AGZ03662); Meretrix meretrix (ADK74377); Pinctada fucata (ACF93446); Aplysia californica (XP_005111546); Ruditapes philippinarum(AEB92230); Crassostrea gigas (ADX06856); Argopecten irradians (ACZ34178); Mytilus galloprovincialis (AHI17300); Homo sapiens IκBa,IκBβ,IκBε (NP_065390,AAH15528,AAC51216); Mus musculus IκBa,IκBβ,IκBε (AAH46754,AAH21938,AAH30923); Rattus norvegicus IκBa,IκBβ (Q63746,AAH85729); Neolamprologus brichardi (XP_006792655); Cyclina sinensis (KP067202)

图3 CsIκB基因在青蛤不同组织中的表达分布Fig.3 The distribution of CsIκB expression in different tissues of C. sinensis不同小写字母代表差异显著(P＜0.05),不同大写字母代表差异极显著(P＜0.01)

为了揭示 CsIκB基因在青蛤免疫体系中的作用机制,本研究进一步检测了青蛤血淋巴中CsIκB基因在鳗弧菌刺激不同时间后的表达量,结果表明;CsIκB基因在刺激后3h上调,6h后其表达量开始下降,并逐渐恢复至正常水平。与合浦珠母贝、菲律宾蛤仔、太平洋牡蛎、文蛤(Zhanget al,2009,2011; Yanget al,2011; Leeet al,2013)的研究结果类似,说明CsIκB基因参与了青蛤的先天性免疫信号转导。CsIκB的诱导机制可能是通过TLRs信号通路识别病原微生物,从而引发下游信号级联反应(Kratsovniket al,2005)。已有研究显示,在栉孔扇贝中存在一条原始的 MyD88依赖型TLRs信号通路(Wanget al,2011)。目前我们已克隆得到青蛤 TLR2基因,以及 MyD88依赖型TLRs信号通路中最关键的接头分子MyD88,并证明它们参与了青蛤的先天性免疫反应(任毅鹏等,2014;高晶等,2015),本研究克隆得到TLRs信号通路下游重要的信号分子CsIκB基因的cDNA序列,这些研究表明青蛤可能存在一条TLRs信号通路并且该通路参与了青蛤对于鳗弧菌刺激的免疫应答。

图4 鳗弧菌刺激下在青蛤血淋巴中CsIκB基因的时序性表达情况Fig.4 The temporal expression of CsIκB in hemocytes after V.anguillarum stimulation##代表该时间点实验组基因的表达量同组注射前(0h)相比差异极显著(P＜0.01),**代表相同时间点实验组与对照组基因的表达量差异极显著(P＜0.01)

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