刘 军，尹惠琼，颜仁和，王 蕊，李红卫，章金刚*，魏建忠

(1.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036；2.军事医学科学院 野战输血研究所，北京 100850；3.南方医科大学 生物技术学院，广东 广州 510515)

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员，为+ssRNA 有囊膜病毒。自Olafson 等1946年首次报道该病毒[1]以来，该病毒已呈世界性分布，主要基因型为1a 和1b。动物感染BVDV 后主要表现为体温升高，采食量下降，反刍次数减少或停止，口腔和鼻腔粘液分泌增多，白细胞数下降，粪便呈水样，母畜表现为产奶量下降，怀弱胎、畸形胎或死胎，给养牛业造成严重的经济损失[2]。

BVDV 基因组仅有一个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码一个约4 000 个氨基酸残基的前体蛋白，两侧为非翻译区(Untranslated region，UTR)。ORF 编码4 种结构蛋白(Core、E0、E1 和E2 蛋白)和7 种非结构蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B)。

利用基因工程方法重组病毒主要保护性抗原用于疾病的预防已经得到广泛应用，E0 蛋白在各病毒株之间相对保守，因此本研究构建携带BVDV E0基因的重组慢病毒载体并包装慢病毒，为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究，基因工程疫苗的研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 慢病毒表达系统(pZJ-CMVeGFP、pAX2、pVsvg)由南方医科大学生物技术学院李红卫教授馈赠；含BVDV E0 序列的pGSI-E0 重组质粒由中美泰和生物技术公司合成；HEK-293T 细胞为本室保存；E.coil 感受态DH5α 购自TaKaRa 公司；限制性内切酶及T4 DNA 连接酶均购自NEB 公司；DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen 公司；质粒小量提取试剂盒购自OMEGA 公司；PEI、HBS转染试剂由本实验室配置[3]；HRP 标记的山羊抗兔IgG(IgG-HRP)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；……