王起明　孙烨超　厉申捷　叶建平

(绍兴文理学院　生命科学学院，浙江　绍兴312000)



白眉长臂猿基因组BAC文库的构建

王起明孙烨超厉申捷叶建平*

(绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴312000)

摘要：通过温和的物理方法获得白眉长臂猿高质量的基因组DNA，EcoRⅠ和EcoRⅠ甲基化酶部分酶切后经回收、连接、转化、阳性克隆的保存，构建了含有85 800个克隆的全基因组BAC(Bacterial artificial chromosome)文库.随机选取250个BAC克隆进行NotI酶切及脉冲场电泳分析，结果表明该文库的平均插入片段大小为110 kb，非重组克隆(无插入片段)的比率为10.0%.假定白眉长臂猿的基因组大小为3×106kb，根据文库的平均插入片段大小，则该文库具有3倍的基因组覆盖率.

关键词：白眉长臂猿；基因组文库；BAC文库

白眉长臂猿(Hylobateshoolock)隶属于灵长目(Primates)长臂猿科(Hylobatidae)，为东洋界缅甸-中国亚区的特有种.白眉长臂猿在国外主要分布于缅甸的北部以及印度东北部的阿萨姆；国内仅见于云南西部怒江以西的腾冲、盈江、保山等地[1-2].由于其种群数量日渐稀少，分布范围狭窄，现已经被列为中国国家I级保护种类[3].目前国内对白眉长臂猿的研究主要集中在种群数量、分布现状以及食物的选择等方面的调查[4-6].如，张兴勇等[4]曾采用走访和现场调查的方式，对保山市隆阳区百花林和赧亢以及腾冲县大塘的白眉长臂猿的数量进行了调查，结果表明调查区内约有白眉长臂猿15～20群，数量25～40只.但目前对白眉长臂猿基因组结构等基础研究却鲜有涉及[7]，究其根源是没有一个良好的基因组研究平台，能对白眉长臂猿基因组研究提供有力的支持.

基因组文库是指，由DNA体外重组技术把基因组片段和载体相连并转化宿主细胞而获得的某一特定生物全基因组的克隆集合.集合中的每个克隆包含有一段特定的基因组DNA.由于体外重组使用的载体与用于保存基因组DNA片段的生物宿主系统不同，因而基因组文库有许多类型.与其它基因组文库相比，细菌人工染色体文库(BAC Library)具有以下优点：(1)大肠杆菌F质粒中的F因子使得BAC克隆以单拷贝的形式存在于重组酶Rec-缺陷型的大肠杆菌宿主中，这使得BAC DNA在细菌中十分稳定，与YAC文库相比，很少有嵌合体存在；(2)由于BAC DNA是以超螺旋的形式存在于宿主菌中，因此通过普通的碱裂解法可以方便地提取到完整的BAC DNA；(3)BAC载体可容纳的插入片段较大，最高可达300 kb，片段中包含足够多的基因组信息，适用于许多研究领域.这些优点都使其在动植物基因组研究中得到广泛的应用[8-9].

构建白眉长臂猿基因组BAC文库不仅有利于永久保存和有效利用其基因资源，同时也可为全基因组测序的顺利完成奠定基础，并为比较基因组研究提供重要资源.

1材料与方法

1.1　材料

实验用白眉长臂猿材料来源于EBV转化的淋巴细胞；构建BAC文库则采用美国Epicentre公司的CCBAC1E BAC文库构建试剂盒.

1.2　方法

1.2.1高分子量基因组DNA的制备

将白眉长臂猿细胞液置于50℃水浴中预热5 min，加入等体积、冷却至50℃的1%低熔点琼脂糖，充分混匀后快速分装至预先用紫外线照射且置于冰上的栓块模具中，每个小槽约80 μL，冰上凝固约1 h，形成琼脂糖凝栓块(Plug).取出凝固好的栓块，置于50℃的L缓冲液(含100 mM EDTA，10 mM Tris-Cl，20 mM NaCl，1%十二烷基肌酸钠，0.2 mg/mL的蛋白酶k，pH 8.0)中消化，直至得到质地均匀、完全透明的栓块，栓块有琼脂糖包裹着的高分子量基因组DNA.裂解后的栓块放入50倍体积冰冷的1×TE(pH 7.6)中，并置于4℃冰箱的摇床上重复洗栓块3次，每次30 min.将栓块转到含有40 μg/mL苯甲基磺酰氟的1×TE中，50℃水浴30 min后，即可将栓块转到20%的NDS(2 mM Tris，6.8 mM N-laruoylsarcosine，127 mM EDTA，pH 9.0)中，于4℃储存备用.

1.2.2EcoR I酶切条件的确定

由于不同物种的基因组DNA对于EcoR I的敏感程度不一样，为获得合适的酶切条件，需要对EcoR I和EcoR I甲基化酶的相对用量进行酶切反应的条件优化.取3块栓块切成6小块后，分别放入含有420 μLEcoR I 缓冲液，1.25 μl SAM，5 μL 100×BSA，1 UEcoR I(使用前用EcoR I缓冲液稀释成0.1 U/μL，取10 μL)和梯度的EcoR I甲基化酶(0，5，10，25，50，100 U)的2 mL离心管中，冰浴30 min使酶渗透到栓块内部与DNA充分接触，然后将离心管置于37℃水浴酶切2 h.消化后的栓块转入20 % NDS以终止反应.脉冲场电泳以温度14℃、6 V/cm、角度120°、脉冲时间0.1～40 s 、14 h的条件检测酶切结果，以确定EcoR I甲基化酶的最适用量.

1.2.3部分酶切和大片段DNA的二次回收

根据上述实验确定的EcoR I和EcoR I甲基化酶的最适用量，进行大量酶切栓块DNA，并进行脉冲场电泳.电泳后切下两边的marker和一小部分的DNA，并用溴化乙锭染色以确定100～200 kb DNA片断的范围.从未染色的凝胶块中间部分切割分子量大小在100～200 kb之间胶块，并将其按照大小100～150 kb，150～200 kb分成两份后，重新嵌入到新配制的胶中进行第二次脉冲场电泳，以去除缠裹在大片段内部的小片段DNA.电泳后切割分子量约100～200 kb之间的胶块放于透析袋中，电泳透析回收DNA 大片段.

1.2.4BAC文库的构建

将经EcoR I酶切、回收获得的大片段DNA与载体按照CopyControl BAC Cloning Kit说明15℃连接过夜.将连接产物置于0.5×TE (pH 8.0)的微孔过滤膜(0.025 μm，Millipore)上，透析2 h，以除去连接反应中的盐.用广口枪头取2 μL 除盐后的连接产物与20 μL感受态细胞混匀，进行电激转化(条件为：电压1.5 kV，电容 25 μF，电阻100).电击后的所有产物加入到1 mL SOC培养基中，于 温度37℃、转速200～250 r/min的摇床上培养1 h后，取100 μL培养物涂在LB 固体培养基上(含有12.5 μg/mL氯霉素， 20 μg/mL X-gal以及0.1 mmol/LIPTG)，37℃培养过夜.选取阳性克隆保存于384 孔培养板，-70℃保存.

1.2.5BAC文库质量检测

文库建成后，随机选取250个克隆分别接种到含氯霉素(12.5 mg/mL)的LB培养基中培养，以检查插入片段大小与空载(无插入片段)比例.碱裂解法提取质粒DNA后，用限制性内切酶NotⅠ酶切，脉冲场电泳检测插入片段大小.根据Clack 和Caron的经验公式，计算BAC文库的覆盖率.

2结果与讨论

本研究构建的白眉长臂猿BAC文库共包含85 800个克隆.为了估计构建的BAC文库插入片段的大小，随机挑选了250个克隆，提取质粒DNA，NotI酶切后，经脉冲场电泳检测.检测结果表明，2.4%的克隆插入片段小于60 kb，3.2%的克隆插入片段大于 180 kb，大约66%的克隆插入片段大小在100~160 kb之间，76.8%的克隆插入片段大于100 kb(图1).所挑选的克隆平均插入片段大小约为110 kb，其中非重组克隆(无插入片段)数为25个，比率为10.0%.白眉长臂猿基因组大小若按照3.0×106kb计算，根据估算的插入片段大小，本研究所构建的BAC文库大约覆盖3倍的白眉长臂猿基因组大小.

图1　BAC克隆插入片段大小分布图

构建BAC文库对于基因组较大的真核生物基因组学研究很重要，构建过程复杂，操作的步骤较多，难度大，其中高质量的高分子量基因组DNA的提取是整个文库构建中最关键的步骤，与片段的大小、克隆的效率、覆盖率等有直接的关系.大片段DNA的选择可以有效提高插入片段的大小和克隆的效率.在文库构建过程中，除酶切外，大片段DNA的操作全部在冰上进行，同时使用广口枪头进行移液，这样可以有效防止DNA的物理损伤和降解.在进行脉冲场电泳分离大片段DNA时，由于样品的浓度高，一些小的DNA片段难免会嵌在大片段的DNA里，所以一般要采取多次分离的方法尽可能地去除小片段DNA.在本研究中，我们利用2次脉冲电泳分离回收的方法，尽可能地淘汰小片段DNA，以提高文库目的片段的纯度和浓度.

本文库非重组克隆比率为10.0%，与高质量BAC文库相比，非重组克隆比率偏高.非重组克隆比率高一方面降低了文库平均插入片段的大小，另一方面加大了后续的工作量，从而在整体上影响了文库的质量.影响文库非重组克隆比率的因素有：(1)载体.制备载体时，由于EcoR I的星号活性，会造成一些非特异性的酶切位点，尽管这些非特异性的酶切位点比率非常低，但也会影响文库的非重组克隆比率.(2)连接反应的时间也会影响非重组克隆的比率.有文献认为4 h是连接的最佳反应时间，超过4 h会增加非重组克隆的比率.(3)载体与基因组DNA的摩尔比应该为10∶1至5∶1.

综上所述，本研究所构建的基因组BAC文库，可以进一步为白眉长臂猿的基因组研究提供必备平台.

参考文献:

[1]蓝道英,马世来,李寿昌,等.白眉长臂猿鸣叫的时间特征[J].动物学研究,1999,20(4):273-277.

[2]蓝道英,马世来,韩联宪.滇西白眉长臂猿(Hylobateshoolock)分布、数量和保护[A].见:张洁.中国兽类生物学研究[M].北京:中国林业出版社,1995:11-19.

[3]国家林业部和农业部.国家重点保护野生动物名录[S].1989.

[4]张兴勇,白冰,艾怀森,等.云南高黎贡山自然保护区白眉长臂猿种群及数量现状初报[J].四川动物,2007,26(4):856-858.

[5]范朋飞.中国长臂猿科动物的分类和保护现状[J].兽类学报,2012,32(3):248-258.

[6]张兴勇,周伟,吴建普,等.高黎贡山赧亢白眉长臂猿春季食物选择[J].动物学研究,2008,29(2):174-180.

[7]张亚平.长臂猿的DNA序列进化及其系统发育研究[J].遗传学,1997,24(3):231-237.

[8]Cao W, Fu B, Wu K, et al. Construction and characterization of three wheat bacterial artificial chromosome libraries[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(12): 21896-21912.

[9]Li R, Fan W, Tian G, et al. The sequence anddenovoassembly of the giant panda genome[J]. Nature, 2010, 463(7279): 311-317.

(责任编辑邓颖)

Construction of Genome Bacterial Artificial Chromosome Library ofHylobatesHoolock

Wang QimingSun YechaoLi ShenjieYe Jianping

(School of Life Sciences, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000)

Abstract：High quality genomic DNA ofHylobateshoolockwas obtained by gentle physical homogenization. The DNA was partially digested withEcoRⅠandEcoRⅠmethylase, and cloned to pCC1BAC vector. The positive clones were stored in 384-well plates. The constructed BAC library consists of 85800 clones. DNA from randomly selected 250 BAC clones was restricted withNotI restriction enzyme and fragments were separated by pulsed field gel electrophoresis. The result shows that the average insert size is estimated as approximately 110 kb, and the ratio of non-recombinant clones is 10.0%. If the genome size ofHylobateshoolockis 3×106kilobase, the library could cover 3 times the number of genome.

Key words：Hylobateshoolock; genomic library; bacterial artificial chromosome library

中图分类号：Q953

文献标志码：A

文章编号：1008-293X(2015)10-0013-03

doi：10.16169/j.issn.1008-293x.k.2015.10.03

*收稿日期：2015-11-29基金项目：浙江省自然科学基金青年科学基金资助项目(LQ12C04002)

作者简介：王起明(1994-)，男，浙江台州人，主要从事动物学方面的研究.通讯作者：叶建平(1980-)，男，浙江衢州人，博士，讲师，研究方向：动物学.E-mail：yejp02@126.com