袁柳祥 李厚华 贾彩霞 徐曼 唐豆豆 刘小微 包努恩都特

(西北农林科技大学，杨凌，712100) (武汉设计工程学院) (西北农林科技大学)

责任编辑:潘 华。

苹果属植物(Malus)主要分布于北温带，其野生种主要分布在东南亚、西亚、东亚、欧洲、北美这5大基因分布中心，我国是苹果属植物起源中心之一［1］。海棠是苹果属植物中果实直径小于5 cm 的类型［2］。海棠中存在着许多果实的果皮和果肉同为红色的类型。这些红色物质，主要为花青苷。花青苷是是一种黄酮类色素，具有抗氧化作用［3］，对人体有保健功效。苹果是深受人们喜爱的水果，位居“功能食品”之首，苹果中含有大量的苹果多酚、三萜和植物甾醇、蛋白质、糖分、维生素和微量元素等，其中黄酮类化合物是苹果中含量最高的一类成分［4］，花青苷就是其中一种黄酮类化合物。普通苹果的花青苷主要来源于果皮中，果肉中几乎没有，而人们处于安全等因素的考虑，吃苹果时常常将其果皮削去。于是，红果肉海棠成了一个新颖的研究材料，通过杂交育种得到红果肉苹果新品种，将能满足人们对苹果营养与保健功能的需求。杂交育种亲本的选择至关重要，不仅亲本要携带有目的基因或目标性状，而且要扩大亲本间的遗传差异。传统育种方法虽然可行，但其受育种家经验和时空的限制比较明显。利用AFLP 分子标记技术，从DNA 水平上检测品种及品系间的遗传差异，不仅能提高品种鉴定的可靠性，更能为杂交育种的亲本选择提供借鉴。

近几年分子标记技术如SSR［5］、RAPD［6］、AFLP［7］等已经广泛被用于苹果亲缘关系及遗传多样性方面的研究。Dunemann 等［8］运用RAPD 标记得出矮苹果(M.pumila)和森林苹果(M.sylvestris)在栽培苹果的起源中起作用;王涛等［9］对20 个重要苹果砧木建立了AFLP 指纹图谱，分析了砧木间的亲缘关系，聚类结果将所试材料聚类为2 个大组，与前人研究的苹果砧木系谱一致;梁国鲁等［10］用AFLP 技术对苹果属23 个种共31 个类型分析，验证了传统分类的正确性，对难以界定的种进行了分类。本研究以红果肉海棠为研究对象，加上部分苹果栽培种以及苹果属野生种作为参照，运用AFLP 分子标记的方法对30 个供试材料的亲缘关系以及起源进行了探讨，为今后分子杂交培育红果肉苹果新品种提供理论依据。

1 材料与方法

23 份红果肉苹果属植物样本和6 份对照样本(见表1)分别采集于西北农林科技大学种质资源圃和北京植物园。于春天选取幼嫩叶片，-70 ℃保存备用。

杂交育种时，子代会遗传父本或母本身上的某些性状。因此，亲本的选择非常重要。苹果属植物的果实红色分布类型不同，有的只集中在果核，有的在中果皮外层，有的从表皮到果核全为红色;红色深度也从浅红晕到深红色不等;果实大小从最小的不足1 cm 的撒氏到5 cm 以上的新疆野苹果。因此，从果实红色类型、程度，果实大小等方面对30 份供试材料做出定性测定(表2)。

表1 供试材料

DNA 提取:采用植物基因组DNA 试剂盒提取各试验材料的基因组DNA。提取的DNA 用1%琼脂糖凝胶检测纯度，用紫外分光光度计测定DNA 浓度。稀释DNA 至50 ng/μL，-20 ℃保存。

AFLP 分析:采用Vos et al［11］的方法并稍作改动。反应程序如下:内切酶采用EcoR I 和Mse I 对基因组DNA 进行双酶切，用T4DNA 连接酶进行连接，酶切连接一步完成，PCR 仪上37 ℃3 h，得到DNA 稀释10 倍后用于预扩增。预扩增采用Mse I+C/EcoR I+A 引物组合，预扩增程序为:94 ℃30 s，56℃30 s，72 ℃1 min，24 个循环;72 ℃10 min。对预扩增的PCR 产物稀释10 倍，采用能产生清晰条带的4 种引物组合对稀释产物进行选择性扩增。选择性扩增程序:94 ℃30 s，65 ℃(每次循环降低0.7℃)30 s，72 ℃1 min，12 个循环;94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，24 个循环;72 ℃10 min，-20 ℃保存。

选择扩增反应结束后在体系中加入5 μL Loading buffer 变性缓冲液混匀后，PCR 仪上95 ℃变性8 min，迅速将PCR 管置于冰上以防止复性，然后冰箱-20 ℃保存。本实验采用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，银染的方法进行检测。胶板晾干后在X 线胶片观察灯下观察记录并拍照。

聚类分析:对扩增产物的电泳结果采用“0-1”系统进行统计，观察电泳图谱中同一位置上AFLP 条带的有无，有记为“1”，无记为“0”，形成“0/1”矩阵图输入计算机。采用多变量分析系统(NTSYS2pc，2.10 版)软件中的SM(simple matching)相似性系数法计算遗传相似系数，然后根据相似系数用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析，并绘制成树状图。

2 结果与分析

2.1 AFLP 扩增片段的多态性

从64 对引物组合中筛选出扩增条带丰富、分辨能力强的4 对引物组合，用这4 对引物对30 份样品进行扩增，共扩增出94 条有效条带，其中多态性条带92 条，多态位点百分率为97.9%(表2)。可见试验样本具有较高的遗传多样性，所有的样本都可以与其他样本区分开。图1是引物M-CTC/E-AGC对30 份样本的扩增结果。

表2 4 对AFLP 选择性扩增引物产生的条带多态性

2.2 遗传多样性聚类分析

从图2可看出，30 个植物样品之间的相似系数为0.63～0.95。当相似系数为0.65 时，样品可划分为4 组，A 组中包括6 种欧美海棠高原之火、路易莎、秀场、道格、钻石、红巴伦以及1 种澳大利亚育种的粉女士红果皮苹果。粉女士是澳大利亚用苹果‘Lady Williams’和‘Golden Delicious’杂交育种得出的优良品种。而‘Lady Williams’被认为是由欧洲野苹果(Malus sylvestris)和苹果(M.domestica)授粉而产生的。粉女士与其他六种欧美海棠聚在同一组，这与以上推测结果相一致，说明AFLP 分子标记技术能在分子生物学层面上为物种的起源提供有力证据。

B 组中包括霍巴、丽丝、雷蒙、玛瑙、王族、粉芽、红丽、火焰、完美紫叶、印第安夏天等红果肉杂交种以及野生种新疆红肉苹果、花红和山荆子。其中，已知霍巴海棠是由新疆红肉苹果和山荆子杂交选育得到的第一个玫红系列海棠。雷蒙海棠为新疆红肉苹果和深红海棠的杂交后代，丽丝海棠为雷蒙和三叶海棠的杂交后代，王族、红丽、火焰均为玫红海棠系列天然杂交的后代。这一组是新疆野苹果与山荆子杂交得到的玫红系列的后代。它们的果实红色分布(整个果都是红色)和红色程度(大部分都为粉红)基本相同(见表3)。

表3 材料性状测定

C 组包括印第安魔力、朱砂、三叶海棠、珠眉海棠、绚丽、凯尔斯、撒氏，其中绚丽、凯尔斯为玫红海棠系列品种。撒氏海棠最早在日本园林栽培中出现，形态特征与三叶海棠近似，它与原产中国东部、日本及朝鲜的三叶海棠关系密切，AFLP 聚类结果显示，二者的亲缘关系与之相吻合。珠眉海棠为三叶海棠与近源种杂交的后代，亲本未知的印第安魔力、朱砂聚在此组，由此可以推测它们与三叶海棠的亲缘关系比较近，可对将来找到它们的亲本及相关育种有帮助。

D 组包括新疆野苹果、富士苹果、嘎啦苹果。富士是日本以国光为母本，元帅为父本杂交选育出的苹果优良品种。它与嘎啦((元帅×橘苹)×金冠)和新疆野苹果聚在一起，它们都是果实较大的类型(见表3)，进一步印证了新疆野苹果是现代栽培苹果的祖先的论断。

图1 引物M-CTC/E-AGC 组合对供试样本的AFLP 扩增图谱

图2 30 个供试样本AFLP 分析聚类树状图

3 结论与讨论

本研究中亲缘关系较近的品种紧密的聚在一起，而且具有相同亲本起源的品种相似系数极高。如市场上常见的嘎拉((元帅×橘苹)×金冠)和富士(国光×元帅)，他们都有相同的亲本“元帅”，他们的相似性系数为0.927 5，与刘凤之［12］(2007)用SSR 分子标记得出的聚类分析结果(相似度系数为0.890 3)一致。“丽丝”(M.‘Liset’)是雷蒙和三叶海棠的杂交种，它既有雷蒙的某些特征，又和三叶海棠具有一定的相似性。但在本次聚类中，丽丝与其亲本之一雷蒙‘Lemoinei’聚在一起，他们的相似系数为0.768 1，而与另外一个亲本三叶海棠相对较远，相似系数为0.681 2，这与赵天田等［13］人在研究海棠单株亲本鉴定时得出的一些杂交种在聚类时有向母本聚类的趋势的结论相一致。

杂交育种是一种重要植物育种方式，亲本遗传距离的远近对杂交育种的结果影响很大［14］，如果两个亲本遗传距离过大，可能会因为种间不亲和性而导致杂交不育现象发生，选择亲缘关系相近的亲本作为育种材料能大大提高杂交育种成功率。AFLP 标记从分子水平对植物进行聚类，对植物亲缘关系的分析比较准确可靠，可以在判断亲本遗传距离时提供帮助，为杂交育种亲本选择提供依据。例如，山荆子作为一种良好的砧木，具有根系发达，抗病性好等优点，若想培育一种具有良好抗性的彩色叶红果肉海棠新品种，可参考图2的分子标记聚类分析结果，选择与山荆子遗传相似性高的彩色叶红果肉‘王族’海棠作为亲本与山荆子进行杂交，提高其育种成功率。

通常认为“绚丽”海棠是霍巴海棠天然杂交的结果，但是在本聚类中，绚丽却没有和其母本霍巴海棠聚在一组，这种现象可能是因为其与未知的父本的亲缘关系近似，它和印第安魔力、朱砂、三叶海棠、珠眉海棠、凯尔斯、撒氏一同被聚类在C 组，所以，绚丽海棠的父本可能与C 组中基因近似。当然，另外一种解释是绚丽不是霍巴海棠天然杂交的结实后代，因此，需要进一步的研究来阐明绚丽海棠的起源。另外，王族和红巴伦由于树形近似，枝条开展角度狭窄，枝叶繁密，都具有深紫色叶和光滑枝条，果肉的颜色也都是深红色。虽然他们常被人们混淆，但是用分子标记可以很好地将二者区分开，因此，AFLP 分子标记可以为形态易混淆种或品种的辨认提供可靠依据。

新疆的野生苹果在世界苹果属植物的起源中起着极其重要的作用。Ponomarenko［15］及Janick［16］认为中亚地区(包括哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦、中国新疆地区等)是栽培苹果的起源中心，并提出新疆野苹果是栽培苹果祖先。俞德浚［17］将新疆野苹果(Malus sieversii)列入真苹果组(Eumalus Zabel)的苹果系(Pumilae Rehd.)，首次赋予新疆野苹果在苹果属中的分类地位。在本实验中，新疆野苹果和栽培苹果富士、嘎啦共同聚在D 组，印证了新疆野苹果是栽培苹果祖先这一论断。本研究中的红果肉苹果的亲本在先前都有记载［18-19］。根据记载，几乎所有红果肉海棠变种都可以追溯至新疆红肉野苹果(Malussieversiif.neidzwetzkyana (Dieck)Langenf)。本次聚类分析，许多红果肉海棠都和新疆红肉苹果聚为一组，如霍巴、雷蒙和丽丝等，这验证了新疆红肉苹果是现代红果肉海棠起源的观点。新疆红肉苹果红色芽，开单花红色，约4～5 cm，果实紫红色，果肉红色，果径约5～6 cm，发现于中国边界的天山，新疆红肉苹果的无性繁殖苗给现代海棠带来了的巨大变化，它的嫩叶、芽、花、果(包括果肉)、枝干均为红色，因为它独特的颜色，被大量用于杂交。从单独的样本来看，虽然本次聚类中新疆红肉苹果与新疆野苹果未聚在同一组，有一定差异，但大部分品种的遗传相似性系数都在0.68 以上，总体上比较近，因此以红果肉海棠与当前的栽培苹果品种为亲本进行杂交育种在克服杂交不亲和性方面具有明显的优势。

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