惠 玲，王晓辉，王美亮，杨霄鹏，马明仁，桑春艳，李君红，张富婷

星形胶质细胞在帕金森病(parkinsin＇s disease，PD)［1-2］的发生、发展中发挥着重要作用，依其不同的活性状态可起神经保护或损伤作用，但其确切的作用机制还不十分清楚。现已明确胶质细胞表达D1、D2、D3、D5 受体［3］，具有类似神经元的摄取系统，是多巴胺作用的重要靶细胞。目前针对PD治疗主要是增加脑内多巴胺神经递质含量，促进改善脑内神经元功能，但多巴胺对脑内胶质细胞影响目前并未进行深入研究。早期研究发现，纹状体内直接注射多巴胺可导致神经元凋亡、神经退变，而星形胶质细胞则发生活化和增生［4］。胶质细胞在脑内数量巨大并参与脑内多种功能［5］，阐明多巴胺对胶质细胞功能的影响，对相关疾病治疗具有重要作用。同时多巴胺作为细胞外信号作用于星形胶质细胞，必然引起细胞内系列级联反应，包括不同环节的基因表达［6］。LMO3是多巴胺刺激胶质细胞上调表达基因之一，脑内特异表达，在神经系统发育、分化及肿瘤发生中起重要作用［7-9］;CIB1是有EF手型结构的细胞内钙结合蛋白，在组织细胞中广泛表达，可与LMO3在内的多种蛋白结合，以细胞特异方式在神经发育、神经退行性疾病、细胞分裂和分化、肿瘤发生等过程中发挥重要作用［10-12］。为此，我们检测不同浓度多巴胺处理对C8胶质细胞功能影响;检测不同多巴胺拮抗剂及激动剂处理对C8胶质细胞功能的影响，以探究在此过程中起作用的多巴胺受体;同时检测多巴胺处理对C8胶质细胞内源性LMO3及CIB1表达定位影响，为进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 多巴胺D1受体激动剂SKF-38393、D2受体激动剂quinpirole(MW:292.3)、D1受体拮抗剂SCH-23390(MW:324.24)、D2受体拮抗剂Spiperone(MW:395.5)(以上均购自美国Sigma公司);胶质细胞株C8-D1A购自美国ATCC公司;DMEM培养基购自Gibco公司，新生牛血清购自杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 试验液的制备:称取多巴胺D1受体激动剂0.291 mg、D2受体激动剂0.292 mg、D1受体拮抗剂0.324 mg、D2受体拮抗剂0.395 mg，分别用10 ml PBS溶解，0.2μmol/L滤器过滤，制成100μmol/L的储存液。实验时取储存液0.5μl，用PBS稀释为0.05μmol/L的工作液。

1.2.2 不同浓度多巴胺对C8胶质细胞增殖的影响:取对数生长期C8胶质细胞消化传代并接种于96孔培养板中，每孔接种1.5×104个细胞并加入100μl含10%小牛血清的DMEM中，四周孔加空白DMEM，培养过夜。根据加入多巴胺浓度的不同分为10μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L多巴胺组及空白对照组，每组设5个重复孔，分别培养24、48、72和96 h，培养结束后吸出原有培养液，用D-Hank液洗2次，每孔加入含10%MTT(溶解在5 mg/ml、pH 7.4、PBS 0.01μmol/L 中，过滤除菌，于密闭棕色瓶中4℃保存)无血清培养液100μl，37℃继续孵育4 h终止培养，小心吸弃孔内培养上清液(尽量吸净培养样孔内残余培养液)。每孔加150μl DMSO，振荡10 min，570 nm波长测定各孔吸光度(OD570)，重复3次。

1.2.3 多巴胺受体激动剂及拮抗剂对C8胶质细胞生长的影响:取对数生长期C8胶质细胞消化传代接种于96孔培养板中，每孔0.5×104个细胞，培养过夜，弃原有培养基，换分别含有200μmol/L上述各种多巴胺受体激动剂或拮抗剂的培养基，30 min后除对照组外各组分别加入多巴胺，设为空白对照组(未予任何处理)、多巴胺组(予100μmol/L多巴胺，含 0.001%的抗坏血酸)、D1组(予200μmol/L多巴胺 D1受体激动剂)、D2组(予200μmol/L多巴胺 D2受体激动剂)、aD1组(予200μmol/L多巴胺 D1受体拮抗剂)、aD2组(予200μmol/L多巴胺D2受体拮抗剂)，每组设5个重复孔。培养24 h后吸出原有培养液，MTT法检测各孔吸光度。

1.2.4 不同浓度多巴胺对C8胶质细胞LMO3及CIB1表达定位的影响:六孔板每孔放入盖玻片，接种约2×105个对数生长期C8胶质细胞，培养过夜，次日弃原有培养基，分别加入新配的含10、100、500μmol/L多巴胺培养液，对照组不放入多巴胺培养液，培养24 h。24 h后取出盖玻片，PBS溶液清洗3次，4%多聚甲醛固定细胞。免疫荧光染色:固定的盖玻片用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，1%BSA/0.4%Triton37℃孵育30 min，抗LMO3抗体(1︰50)37℃ 2 h，4℃过夜。PBS漂洗3次，羊抗兔Tritc(1︰50)37℃ 3 h，PBS漂洗3次，每次5 min。1%BSA/0.4%Triton37℃孵育30 min，抗CIB1抗体(1︰50)37℃ 2 h，4℃过夜，PBS漂洗3次，羊抗小鼠FITC(1︰50)37℃3 h，PBS漂洗3次，甘油封片，荧光显微镜观察并拍照。

1.2.5 Hoechst染色检测不同浓度多巴胺对C8胶质细胞核的作用:接种约2×105个对数生长期C8胶质细胞于六孔板盖玻片上，培养过夜，次日弃原有培养基，分别加入新配的含10、100、500μmol/L多巴胺培养液，对照组不加多巴胺培养液，培养24 h后取出盖玻片，用PBS溶液清洗3次，4%多聚甲醛固定细胞，各组细胞爬片后用PBS液浸洗3 min，甩去PBS，滴加200μl Hoechst 33258染液，室温下染色10 min，PBS振洗，3 min×3次。加抗淬灭液封片，荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0软件处理实验数据。实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 不同浓度多巴胺对C8胶质细胞增殖的影响不同浓度多巴胺(10、100、500 μmol/L)处理 C8胶质细胞后，经单因素方差分析，多巴胺作用C8胶质细胞48～96 h，100μmol/L组细胞与空白对照组相比显著增加(48 h时，P＜0.01，72 h及96 h时，P＜0.05);48 h～72 h时，100μmol/L组比10μmol/L组细胞显著增加(48 h时，P＜0.01，72 h时，P＜0.05);而高浓度组(500μmol/L)细胞与其他各组比较，细胞生长明显被抑制(P＜0.05);因此多巴胺对C8胶质细胞的作用与浓度明显相关，本实验低浓度(10μmol/L)对C8胶质细胞无明显影响，中浓度组(100μmol/L)可明显促进C8胶质细胞的增殖，而高浓度组(500μmol/L)则抑制C8胶质细胞生长。见表1及图1。

表1 不同浓度多巴胺对C8胶质细胞增殖的影响(x±s，OD570值)

图1 不同浓度多巴胺对C8胶质细胞增殖的影响

2.2 多巴胺受体激动剂、拮抗剂对C8胶质细胞生长的影响 C8胶质细胞用100μmol/L多巴胺及200μmol/L各种不同多巴胺受体激动剂或拮抗剂处理24 h后，测定OD570值:空白对照组0.0416±0.012;多巴胺组0.0630±0.021;D1组0.0386±0.011;D2组0.0788±0.016;aD1组0.0622±0.009;aD2组0.0936±0.016。经单因素方差分析可见，除D1组外，其余各组OD570值均大于空白对照组(P＜0.05或P＜0.01);多巴胺组OD570值高于D1组，低于aD2组，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);除空白对照组外，D1组OD570值均明显少于其他各组(P＜0.05或P＜0.01)。见图2。提示多巴胺作用于C8胶质细胞主要通过D2受体作用，多巴胺通过D2受体刺激C8胶质细胞增殖，而多巴胺D2受体拮抗剂Spiperone对多巴胺刺激引起的C8胶质细胞增殖有协同作用。

2.3 不同浓度多巴胺处理对C8胶质细胞中LMO3及CIB1定位的影响 通过对比免疫荧光图像可以看出，空白对照组C8胶质细胞中的LMO3及CIB1在胞核及胞浆中均有表达，但以胞核表达为主，核内呈现高亮度的荧光图像，高浓度500μmol/L时C8胶质细胞出现了明显的形态学变化，荧光显微镜下可见核内出现大量空泡，染色质呈斑块状。随着加入多巴胺浓度的升高，CIB1在核内的亮度下降，胞浆中的表达增加，而LMO3无明显变化。见图3。半定量结果显示，与空白对照组比较，低浓度组(10μmol/L多巴胺)处理后显著增加LMO3蛋白表达水平(P＜0.05);与空白对照组相比，高浓度组(500μmol/L多巴胺)降低了CIB1蛋白表达水平 (P＜0.05)。见表3。

表3 不同浓度多巴胺处理对C8胶质细胞中LMO3及CIB1细胞平均荧光强度影响(x±s)

图3 荧光显微镜观察不同浓度多巴胺处理对C8胶质细胞中LMO3及CIB1表达及定位的影响(Hoechst染色×400)

2.4 Hoechst染色检测不同浓度多巴胺对C8胶质细胞核的作用 因为Hochest33258只与DNA结合，故RNA及胞浆均不着色，从而便于观察以核改变为主的凋亡细胞。在紫外光激发下，通过荧光显微镜观察到空白对照组、10μmol/L组及100μmol/L组细胞核大多呈大小一致的圆形，染色均匀，为正常细胞核形态，罕见凋亡细胞，可见较多处于分裂终末期浓缩核，而500μmol/L组C8胶质细胞可见逐渐增多的凋亡细胞核改变，核体积缩小，呈大小不一不规则状，染色不均匀，呈颗粒、块状浓染、染色质浓集、断裂成块、胞核呈现较强的亮蓝色荧光。见图4。

图4 荧光显微镜观察不同浓度多巴胺对C8胶质细胞核形态的改变(Hoechst染色×400)A.空白对照组;B.10μmol/L组;C.100μmol/L组;D.500μmol/L组

3 讨论

已有研究证实，星形胶质细胞可以合成和释放神经递质、神经营养因子，这些细胞通过向微环境中释放生长因子而满足神经元的生长需求［6，13-15］。不同种属及大脑不同部位的星形胶质细胞均能被多巴胺激活。我们研究发现，低浓度多巴胺(10μmol/L)对C8胶质细胞的生长无明显影响，中浓度多巴胺(100μmol/L)可显著促进C8胶质细胞的增殖，而高浓度多巴胺(500μmol/L)则起相反作用，抑制了C8胶质细胞生长。进一步研究发现，多巴胺D2受体激动剂qμinpirole能显著促进C8胶质细胞生长，而多巴胺D1受体激动剂SCH-23390则对C8胶质细胞的生长无影响，表明多巴胺对C8胶质细胞的作用可以通过激活D2受体引起细胞功能的变化。

Khan等［16］研究表明，10～500 μmol/L 多巴胺可以促进转染了多巴胺D2受体的C6细胞(C6-D2L)DNA的合成并促进细胞有丝分裂，而这种作用是通过激活多巴胺D2受体实现的;同时他们的研究还发现，200μmol/L多巴胺可以促进C6-D2L中GFAP的表达，而500μmol/L多巴胺处理组的GFAP表达却明显降低。Hattori等［4］在人体实验中用不同浓度多巴胺注射大鼠的纹状体部位，发现凋亡细胞的比例与浓度成正比。袁崇刚和薛小琳［17］在离体实验中同样观察到高浓度多巴胺(400μmol/L)导致PC12细胞存活率大幅度降低，流式细胞仪观测到凋亡峰，而低浓度多巴胺对细胞存活率无明显影响，说明多巴胺细胞毒性存在浓度相关性。因此提示多巴胺对C8胶质细胞作用有浓度相关性，高浓度多巴胺抑制增殖，促进细胞凋亡，可能与多巴胺神经毒性作用有关。

多巴胺通过受体发挥作用，多巴胺受体属于G蛋白偶联受体(GPCR)，根据其药理学特征和信号转导通路的不同分为D1类和D2类多巴胺受体。D1类受体包括D1、D5两种亚型，D2类受体包括D2、D3、D4三种亚型。现已明确胶质细胞表达D1、D2、D3、D5受体，具有类似神经元的多巴胺摄取系统，是多巴胺作用的重要靶细胞，在脑部疾病的发生中具有重要作用［5］。我们研究发现，多巴胺可以通过D2受体促进细胞增殖，但D2受体拮抗剂spiperone不但不能拮抗多巴胺所引起的C8胶质细胞增殖作用，而且具有协同多巴胺促生长作用，这种现象可能与多巴胺受体超敏性(多巴胺受体拮抗剂诱导受体数目增加)有关。多巴胺受体超敏是多巴胺受体对拮抗剂的反应(包括行为、电生理、靶器官反应)增强现象，它是机体的一种代偿性机制，具有以下特征:受体数目增多、密度升高、D1和D2受体的脱耦联、亲和力增加等［18］。在6-羟基多巴胺单侧损毁的大鼠PD模型上发现，刺激D1或D2受体均能激活磷酸化ERK，而抑制ERK活性后可显著降低D2受体介导的PD大鼠旋转运动，说明ERK在多巴胺受体超敏性的形成中发挥着关键作用［19-20］。痕量胺关联受体1(TAAR1)缺失鼠的纹状体中多巴胺D2受体超表达，而与多巴胺D2受体相关的AKT/GSK3信号通路选择性激活，表明TAAR1与D2受体的超敏功能相关［21］。多巴胺系统参与调节精神和情绪，而多巴胺系统功能异常将导致精神疾病，例如在精神分裂症中，D2受体功能亢进［17-18］，因此临床上使用D2受体拮抗剂作为抗精神病药，但常因多巴胺受体超敏而影响其疗效并引起一些严重不良反应。目前关于胶质细胞与多巴胺受体超敏的研究尚未见报道，由于胶质细胞具有多种多巴胺受体，脑中多巴胺浓度的变化及在抗精神分裂症过程中的多巴胺受体药物治疗对胶质细胞功能也会产生影响，这种对疾病治疗的影响需要引起我们今后的关注。

多巴胺作为细胞外信号作用于星形胶质细胞，必然引起细胞内系列的级联反应，包括不同环节的基因表达。LMO3是多巴胺刺激胶质细胞上调表达的基因之一，本研究发现，在低浓度多巴胺(10μmol/L)作用下，LMO3表达量增加，与我们前期的研究结果一致［22］;LMO3在细胞内的表达以胞核为主，细胞质中也有少量表达。CIB1在高浓度多巴胺(500μmol/L)刺激下，表达量与对照组相比显著减少。而我们已有的研究发现共转染LMO3及CIB1的C8胶质细胞中，两种蛋白在细胞质中共定位，CIB1抑制 LMO3引起的 C8胶质细胞增殖［23］，说明CIB1过表达引起细胞抑制与高浓度多巴胺引起C8胶质细胞生长抑制可能是不同信号通路，对此尚需进一步深入研究。

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