杨 红，郎晓芳，王 勇

大量研究表明，氧自由基引起的脂质过氧化是脑缺血再灌注损伤的重要原因之一，大量自由基的连锁反应激化，造成细胞膜的脂质过氧化损伤，最终导致神经细胞发生凋亡，这个病理过程是一个快速级联反应，各个环节相互影响、互为因果关系［1-3］。关于高压氧治疗脑缺血再灌注损伤的研究很多，但其具体作用机制仍存在较大的争议［4-5］。银杏叶提取物注射液(商品名:金纳多注射液)是新一代的银杏叶提取物制剂，主要活性成分是杏黄酮苷和萜类内酯，这些活性成分具有捕获游离基、改善微循环、调节血小板活性等功效［6-8］。段长虹等［9］通过大鼠模型证实银杏叶提取物能抑制脑局灶性缺血再灌注损伤。但关于高压氧联合银杏叶提取物保护缺血再灌注脑损伤的研究还未有报道，本实验对其保护作用的具体机制进行探讨，为今后的临床治疗提供一定的实验性依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 主要试剂:银杏叶提取物注射液(中国台湾济生化学制药股份有限公司提供，规格:17．5 mg/支，批号:140231B);血小板活化因子(PAF)为博奥森生物技术有限公司产品;甘肽过氧化物酶(GSHPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧类物质(ROS)活性检测及丙二醛(MDA)含量检测试剂盒均为南京建成生物科技公司产品。

1.1.2 主要仪器:ASD-310S型低温离心机为美国Sigma公司提供;DWC450-1150型动物实验舱仪器为上海医疗仪器厂提供。

1.2 实验动物与分组 选取健康清洁级性成熟雄性SD大鼠(中国医科大学实验动物中心提供)50只，体重250～300 g，术前6 h禁食水。随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、银杏叶提取物组(C组)、高压氧组(D组)和银杏叶提取物+高压氧组(E组)，每组10只。

1.3 模型制备及处理 采用改良的Longa等［10］所采取的右侧颈内动脉尼龙线线栓法制备脑缺血再灌注损伤模型，步骤:大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(0．35 ml/100 g)麻醉，将大鼠仰卧位后固定好大鼠四肢于手术台上，用生理盐水清洗干净颈部后备皮，用碘酊消毒皮肤，75%乙醇脱碘，再用无菌盐水清洗颈部，颈部正中纵向切开4～5 cm，沿胸锁乳突肌内侧钝性分离肌肉和深、浅筋膜直至暴露出右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)、翼腭动脉(ICA分支)，结扎翼腭动脉，用微动脉夹夹闭ECA、ICA，距CCA分叉处0．4 cm处断离ECA，结扎远心端断端，在近心端向CCA分叉处牵引，尽量使其与ICA在一条直线上，在ECA断端插入经肝素浸泡的尼龙线线栓，用眼科镊缓慢推进，从血管分叉处开始计算距离，当插入深度约20 mm时立即停止，结扎ECA断端，用无菌生理盐水清洗干净后用稀释的聚维酮碘冲洗切口后立即开始计时，阻断20 min后，重新按照上述方法麻醉、固定大鼠并按上述解剖层次重新暴露血管，缓慢拔出尼龙线线栓至ICA断端，缝合切口，术中维持肛温36．5～37．5℃。各组处理方法:A组切开颈部皮肤、筋膜、肌肉暴露血管后经颈静脉注射相同体积的生理盐水，并分离颈部血管后缝合切口;B组在插入尼龙线线栓前30 min经颈外静脉给予颈静脉注射相同体积的生理盐水;C组在插入尼龙栓线线栓前30 min经颈外静脉给予银杏叶提取物2 mg/kg;D组在插入尼龙线线栓前30 min经颈外静脉给予颈静脉注射相同体积的生理盐水，缝合后将大鼠立即置于实验动物舱内，纯氧洗舱5 min，使舱内氧浓度＞90%，进行匀速升压10 min至2．5 ATA后稳压，吸纯氧45 min，减压15 min后大鼠出舱，处理时保持通风，舱内放入少许碳酸钙以吸收二氧化碳;E组银杏叶提取物给药方法同C组，高压氧治疗方法同D 组［11］。

1.4 取材与样本检测 分别在再灌注2、3、6、24 h后，抽取大鼠尾缘静脉血用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定PAF浓度，将血清在离心机10 000～15 000 r/min离心，匀浆时间10 s/次，间歇30 s，连续3或4次，温度4℃，按试剂盒说明测定GSH-PX、SOD与ROS活性并检测MDA含量。所取标本均在1周内测定。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13．0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间同一时点两两比较采取单因素方差分析，组内各时点的比较采用重复测量方差分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 血清氧化相关物质 B、C、D、E组大鼠各个时间点外周血清 GSH-PX、SOD活性均低于A组，而ROS、MDA均高于 A组(P＜0.05);C、D、E组大鼠各个时间点外周血清GSH-PX、SOD活性值均高于B组，而ROS、MDA均低于B组(P＜0.05);D、E组大鼠各个时间点外周血清 GSH-PX、SOD活性值均高于C组，而ROS、MDA均低于D组(P＜0.05);E组大鼠各个时间点外周血清GSH-PX、SOD活性值均高于 D组，而 ROS、MDA均低于 D组(P＜0.05)。除A组外，其余4组GSH-PX、SOD活性均于再灌注后3 h开始下降，6 h达到最低值，24 h开始升高，而ROS、MDA均于再灌注后3 h开始升高，6 h达到高峰，24 h开始下降(P＜0.05)。见表1～4。

表1 5组大鼠脑缺血再灌注不同时间外周血甘肽过氧化物酶水平(x ± s，μmol/L)

表2 5组大鼠脑缺血再灌注不同时间外周血超氧化物歧化酶水平(x ± s，U/ml)

表3 5组大鼠大鼠脑缺血再灌注不同时间外周血活性氧类物质水平(x ± s，U/ml)

表4 5组大鼠脑缺血再灌注不同时间外周血丙二醛水平(x ± s，nmol/ml)

2.2 PAF水平 B、C、D、E组各个时间点大鼠外周血清PAF均高于A组，C、D、E组低于B组，D、E组低于C组，E组低于D组(P＜0.05)。除A组外，其余4组PAF均于再灌注后3 h开始升高，6 h达到高峰，24 h开始下降(P＜0.05)。见表5。

表5 5组大鼠脑缺血再灌注不同时间外周血血小板活化因子水平(x±s，μg/L)

3 讨论

目前研究证实高压氧治疗疾病的机制主要是在高压状态下，氧气在组织内的溶解量及其弥散程度加大，并经过循环系统进入人体各组织、细胞，特别是进入缺氧较严重的组织中，进一步纠正缺氧，延缓因缺氧导致的组织、细胞损伤，促进组织细胞的修复［12-14］。有研究证实了银杏叶提取物具有改善微循环、降低血脂、提高免疫力、抗菌消炎、抗氧化、清除机体自由基等功效［15-17］，以往大量临床试验与动物实验均已证实了银杏叶提取物对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用［18-21］。

线粒体是细胞内能量物质生成与储存的重要场所，对缺血缺氧非常敏感，正常情况下，细胞内部有着完整的抗氧化体系，如SOD、GSH-PX等，还有抗氧化剂如维生素E、维生素C等及机体自身的调控技能如脂肪酶、蛋白酶、DNA修复酶等，体内的自由基处于生成和清除的平衡状态时不损伤机体，脑缺血时线粒体不能进行有氧氧化，三磷腺苷(ATP)产生减少，再灌注血液突然进入时带来的氧气只能在蛋白激酶C、髓化过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶催化生成ROS、单线态氧、过氧化氢和氢过氧基等同时产生大量类脂类物质，大量的ROS、MDA产生，超出了SOD、GSH-PX等酶的清除能力，造成过氧化物质集聚，由于神经组织具有很高的氧化代谢水平及含量丰富的脂肪酸，易受自由基攻击［22-24］。本研究结果显示，B、C、D、E 组大鼠外周血清中GSH-PX、SOD 活性均较A组降低，而ROS活性与MDA浓度较A组升高，C、D、E组大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性均较B组升高，而ROS活性与MDA浓度较B组降低，且E组效果最好。提示缺血再灌注后体内存在过氧化损伤与氧化活性物质的堆积与抗氧化酶活力降低，而高压氧与银杏叶提取物均能很好的提高抗氧化酶活力，降低氧化物质的浓度，通过这一途径保护脑组织。

PAF作为一种重要的炎性因子，可以通过促进血栓形成、降低脑血流量、加重脑水肿等多种方式影响神经细胞功能，并参与脑血管疾病的发生发展过程［25］。银杏叶提取物中的银杏黄酮为重要的PAFR拮抗剂，可竞争性抑制PAF与PAFR结合，减轻细胞毒作用，保护脑细胞［6］。本研究结果显示，B、C、D、E组PAF浓度较A组升高，且C、D、E组较B组降低，E组低于C、D组。提示缺血再灌注损伤后体内PAF浓度升高加重脑损伤，银杏叶提取物与高压氧能降低其PAF浓度保护脑组织。

本研究结果还显示，除A组外，其余4组GSHPX、SOD活性均于再灌注后3 h开始下降，6 h达到最低值，24 h开始升高，而 ROS、MDA、PAF均于再灌注后3 h开始升高，6 h达到高峰，24 h开始下降，结果与傅敏等［5］研究结果相同。提示缺血再灌注6 h后氧化损伤最重，24 h后氧化物质活性降低，而抗氧化能力逐渐升高。

综上所述，高压氧联合银杏叶提取物能很好地降低脑缺血再灌注氧化应激反应的发生而保护脑组织，进一步证实了其抗氧化清除自由基的能力，为今后的临床实践提供了很好的参考价值。赵旸和黎七雄［26］证实神经苷脂联合高压氧能很好地改善缺血再灌注小鼠的学习记忆能力，但是银杏叶提取物联合高压氧对学习记忆能力的影响还需要我们去进一步研究探讨。

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