郑国栋 陈 杰 蒋霞云 邹曙明

(上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306)

长江草鱼不同群体EST-SSR多态性标记的筛选及其遗传结构分析

郑国栋 陈 杰 蒋霞云 邹曙明

(上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306)

为对我国不同地域草鱼群体进行鉴定和遗传多样性分析, 在2400条草鱼EST序列中, 对其二碱基至五碱基重复序列进行筛选, 共筛选出微卫星位点181个, 选取其中的46个进行引物的设计与合成, 获得呈多态性的微卫星引物9对。利用这9对引物对8个长江水系草鱼群体和1个红色草鱼自然突变群体进行了遗传结构分析。结果显示, 长沙草鱼、安庆草鱼、嘉兴草鱼、靖江草鱼、石首草鱼、松江草鱼、瑞昌草鱼、邗江草鱼和红色突变草鱼9个群体的平均等位基因数(Na)分别为4.67、5.22、5.33、5.00、4.89、4.78、4.89、4.67和2.56, 平均期望杂合度(He)分别为0.6397、0.6543、0.6831、06356、0.6737、0.6483、0.6664、0.7129和0.4696, 平均多态信息含量(PIC)分别为0.5787、0.6126、0.6283、0.5894、0.6217、0.5956、0.6136、0.6582和0.3949, 表明邗江草鱼的遗传多样性最高, 而红草鱼的遗传多样性最低。聚类分析表明, 8个长江水系草鱼群体首先聚类, 最后与红色草鱼聚类； 其中, 安庆草鱼与松江草鱼首先聚为一支, 遗传距离较近, 为 0.0725； 红色草鱼与长沙草鱼的遗传距离最远, 为0.5217。研究结果对我国草鱼种质资源保存、种群鉴定和良种选育具有重要意义。

草鱼； EST-SSR； 遗传结构； 长江水系

草鱼(Ctenopharyngodon idella), 鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属的唯一一种鱼类。草鱼作为我国的四大家鱼之一, 因具有生长迅速, 个体大, 肉质肥嫩, 肌间刺少等特点而备受广大养殖户和消费者喜爱。草鱼广泛分布于我国江河、湖泊中, 在我国淡水养殖业中占有重要的经济地位。草鱼的种质资源在我国曾非常丰富, 近几十年来, 由于过度捕捞、鱼类病害、盲目近亲交配以及草鱼生境的破坏, 使我国的草鱼天然种质资源发生了严重的衰退[1—3]。因此, 保留中国优良草鱼品种, 以及增加其生物多样性是解决草鱼种质资源退化的根本措施。目前, 针对长江水系草鱼群体, 王解香等[4]利用EST-SSR标记, 范玉顶等[5]、廖小林等[6]、张志伟等[7]及傅建军等[8]利用SSR标记分别对长江水系草鱼进行过遗传多样性研究。另在同工酶[9]、(RAPD)[11]、(mtDNARFLP)[10]、细胞色素B序列多态性标记[12]方面, 也做过相关的研究。但得出的结论不尽相同, 因此运用新的分子标记对其进行补充研究仍有重要意义。

目前, 关于EST-SSR标记用于草鱼的研究还比较少。相对于传统的基因组微卫星标记, EST-SSR具有在基因组中分布均匀、呈共显性遗传、数量丰富、实验重复性好等特点[13], 同时由于部分EST来源于基因的编码区, 所以能更直接、准确地标记功能基因, 更真实地反映该物种的遗传多样性[14—17], EST-SSR已成功应用于群体遗传结构分析、QTL定位和分子标记辅助选择育种等研究领域[18—20]。本研究拟通过从草鱼的众多EST序列中筛选出优良的EST-SSR标记, 以8个长江水系草鱼群体和1个红色草鱼突变群体为研究材料, 进行遗传结构的分析, 从而为我国草鱼种质资源保存、种群鉴定和良种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

9个草鱼群体包括 8个长江水系群体(长沙草鱼、安庆草鱼、嘉兴草鱼、靖江草鱼、石首草鱼、松江草鱼、瑞昌草鱼和邗江草鱼)和1个草鱼红色自然突变群体(图1), 均保存于上海海洋大学水产动物遗传育种中心。其中, 长沙草鱼、嘉兴草鱼、靖江草鱼、石首草鱼、瑞昌草鱼和邗江草鱼系原种, 安庆群体和松江群体系自繁群体, 红色草鱼突变体系红色自发突变体自繁后代, 具体的采样数量信息见表1。每个群体随机剪取30尾鱼鳍, 共270尾, 放入95%的酒精中, 保存于–20℃备用。

1.2 微卫星引物的筛选

根据 NCBI系统中的草鱼 EST数据库, 应用SSR软件在线查找EST-SSR, 查找中使用的标准是:二碱基重复单元重复次数为5次以上(包括5次), 三碱基以上重复单元重复次数均为 4 次以上(包括 4次)[4], 包括复合型微卫星。使用Primer5.0进行引物设计, 引物长度控制在18—24 bp 之间, GC含量在40%—60%, Tm值控制在 50℃—65℃, 产物长度控制在100—350 bp, 最后合成EST-SSR引物46对。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 基因组DNA的制备

参照北京天根生物科技有限公司生产的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书介绍的方法提取样品基因组DNA。基因组DNA提取完成后, 用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA质量和浓度, 保存于–20℃备用。

1.4 PCR反应体系与扩增程序

反应体系 10 µL, 包含 5 µL含染料的 2×Taq PCR MasterMix (Taq DNA Polymerase: 0.1 U/µL；MgCl2: 4 mmol/L； dNTPs each: 0.4 mmol/L), 上下游引物各0.5 µL (10 µmol/L), 0.5 µL 模板DNA(30—50 ng), 3.5 µL ddH2O。PCR反应在Eppendorf Mastercycler ep gradients型 PCR仪上进行, 反应程序为: 94℃预变性 5min, 94℃ 30s, 52—62℃(可据表 1进行调整)30s, 72℃ 30s, 30个循环, 最后72℃延伸10min。

1.5 PCR产物凝胶电泳检测

PCR 产物在 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳, 胶片大小为 195 mm (长)×120 mm (宽)× 1 mm (厚)。产物上样量均为 1 µL, DNA Marker (pBR322 DNA/Msp Ι)上样量为 0.5 µL。电泳条件:电泳缓冲液为1×TBE, 电压200 V, 电泳1.5—2h (具体时间根据 PCR产物分子量大小而定)。电泳完成后, 进行硝酸银染色, 染色方法参照张倩倩等[21]的方法进行。最后将胶片平铺于观片灯箱上, 拍照并保存。

图1 普通草鱼(上)和红色草鱼(下)Fig. 1 Common grass carp (upper) and red grass carp (lower)

表1 九个草鱼群体采集地点及基本信息Tab. 1 Sampling sites and information of the grass carp samples

1.6 数据统计与分析

用Quantity One凝胶图像分析软件分析微卫星条带大小, 根据每个个体产生的条带位置确定基因型。用Popgene(Version 1.32)软件进行分析, 计算每个微卫星座位分别在 6个群体中的等位基因数(Number of alleles, Na)和期望杂合度(Expected heterozygosity, He), 并计算群体间的Nei’s遗传相似性(Genetic identity)和遗传距离(Genetic distance), 并基于该遗传距离利用MEGA 5.1软件对9个草鱼群体进行基于非加权组平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA) 的树状聚类图的绘制。最后用Cervus 3.0软件计算多态信息含量(PIC)。

2 结果

2. 1 EST-SSR引物的筛选

根据 NCBI系统中的草鱼 EST数据库, 应用SSR软件在线查找EST-SSR, 在2400条EST序列中共发现微卫星位点181个, 占EST序列的7.54%,其中包括二碱基重复序列 116条, 三碱基重复序列45条, 四碱基重复序列19条, 五碱基重复序列1条； 二碱基重复序列最为丰富, 共占64.09%, 其中(AC/CA/TG/GT)n形式在二碱基重复中最为常见(表2)。

表2 草鱼EST-SSR的类型及分布特点Tab. 2 The type and number of EST-SSRs

2.2 EST-SSR引物的设计及多态性检测

在 181条含有微卫星的 EST序列中, 选取 46条微卫星序列进行了引物的设计、合成, 对30尾草鱼样本进行PCR扩增, 最终获得呈多态性的引物9对(表 3), 另有 37对引物只能扩增出单一条带或无条带, 多态性引物占所有设计引物的19.57%。多态性引物中双碱基重复占88.89%, 双碱基重复序列又以(AC/GT)n为主。这9对引物在所研究的9个草鱼群体中均具有群体间相容性高、多态性良好等特征,部分引物在草鱼群体中的扩增图谱(图2)。

表3 微卫星引物特征Tab. 3 Characteristics of microsatellite primers

图2 EST307(上图)在长沙草鱼和EST3746 (下图)在红草鱼群体中的PAGE图谱Fig. 2 PAGE analysis by primers EST307 (upper) in Changsha group and EST3746 (lower) in red group

2.3 九个草鱼群体的SSR扩增结果

本研究共计开发出了9对呈多态性的EST-SSR引物, 利用这9对微卫星引物对8个长江水系草鱼群体和1个红色草鱼自然突变群体共270尾样品进行扩增分析, 每个位点检测到的等位基因数4—7个不等, 共检测出54个等位基因。在9个草鱼群体中,长沙草鱼、安庆草鱼、嘉兴草鱼、靖江草鱼、石首草鱼、松江草鱼、瑞昌草鱼、邗江草鱼、红色草鱼9个群体的平均等位基因数(Na)分别为4.67、5.22、5.33、5.00、4.89、4.78、4.89、4.67和2.56, 平均期望杂合度(He)分别为0.6397、0.6543、0.6831、06356、0.6737、0.6483、0.6664、0.7129和0.4696, 平均多态信息含量(PIC)分别为 0.5787、0.6126、0.6283、0.5894、0.6217、0.5956、0.6136、0.6582和0.3949,除了红色草鱼突变群体外基本都为较高的多态性(PIC＞0.5), 能够在分子水平上准确反映各地理群体间和群体内的遗传关系(表4、表5)。从这些遗传参数中可得出, 这 9个群体的遗传多样性由高到低依次为邗江草鱼＞嘉兴草鱼＞石首草鱼＞瑞昌草鱼＞安庆草鱼＞松江草鱼＞靖江草鱼＞长沙草鱼＞红色草鱼,即邗江草鱼的遗传多样性最高, 红色草鱼突变群体的遗传多样性最低。

2.4 不同草鱼群体间的遗传距离和聚类分析

用Popgene(Version 1.32)软件计算草鱼9个群体间的Nei’s相似性和遗传距离(表6)。9个草鱼群体间的Nei’s相似系数为0.5935—0.9300, 遗传距离为0.0725—0.5217。其中安庆群体和松江群体的相似性系数最高, 为 0.9300, 长沙群体和红色草鱼突变群体的遗传相似性最低, 为 0.5935。基于不同群体间Nei’s遗传距离, 利用MEGA5.1软件构建了9个草鱼群体间的UPGMA聚类关系(图3)。结果显示, 8个长江水系草鱼群体首先聚类, 最后才与红色草鱼突变群体聚类； 其中, 安庆群体和松江群体首先聚为一支, 瑞昌群体和邗江群体聚为一支, 然后这两支聚为一支后又与嘉兴群体聚为一支； 靖江群体和石首群体聚为一支, 这支再与前一大支聚类； 最后与长沙群体聚类。其中红色草鱼突变群体与长沙群体的遗传距离最远, 为0.5217。

3 讨论

3.1 草鱼EST-SSR标记的筛选

本研究从草鱼2400个EST 序列中查找获得181个微卫星位点, 占整个ESTs 数据库的7.54%, 这与其他学者在EST中所筛选到的微卫星比率基本一致,其中王解香等[4]在草鱼EST中获得的微卫星比例为2.12%, 王艳红等[22]在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)EST中获得的微卫星的比例是7.80%； 孙国华等[23]在刺参EST 中获得的微卫星比例为6.48%；Wang等[25]在太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)EST中获得的微卫星的比例为4.50%； 石耀华等[24]在马氏珠母贝(Pinctada martensii Dunker)EST中获得含有微卫星的EST的比例为3.48%； 徐鹏等[26]对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的整个EST数据库进行分析, 含微卫星序列的比例为2.19%。总的看来, 微卫星在EST序列中的比例大都在10%以下, 但不同物种之间存在差异, 这可能是由于不同物种基因组的结构组成、容量大小不同造成的。同一物种之间也存在一定差异, 原因可能是每个研究人员在研究中所使用的EST序列来源不尽相同造成的。

本研究所获得的EST-SSR中双碱基重复占有较大的比例, 占64.09%, 其中以(AC/CA/TG/GT)n形式的二碱基重复序列最为常见。这个结论与其他学者所筛选到的微卫星碱基组成类型及比例基本一致,如王艳红等[22]在凡纳滨对虾EST中发现双碱基重复占总EST-SSR序列的80.20%； Wang等[27]、鲁翠云等[28]发现在鲤( Cyprinus carpio)中, (AC/GT)n占所有双碱基重复EST-SSR的67.57%； 一些学者在鲤微卫星中发现双碱重复的微卫星所占比例达到了96.75%, (AC)n所占的比例是(CT)n的7倍[29—31]。这些结果表明,以(AC/CA/TG/GT)n形式存在的双碱基重复序列在鱼类的EST-SSR中占主要部分, 应该成为筛选鱼类EST微卫星的侧重点。

表4 草鱼微卫星位点的等位基因数、期望杂合度Tab. 4 Number of alleles (Na) and expected heterozygosity (He) of microsatellite loci

表5 草鱼微卫星位点的多态信息含量Tab. 5 The polymorphism information content (PIC) of microsatellite loci

图3 不同草鱼群体的UPGMA 聚类图Fig. 3 Dendrogram of relationships among grass carp using UPGMA method of clustering

3.2 九个草鱼群体的遗传结构分析

从遗传角度来讲, 等位基因的数目(Na)、遗传杂合度(He)和多态性信息含量(PIC)等遗传参数可从多个角度反映群体的遗传多样性和遗传潜力[32]。并且,通常认为PIC＞0.5为高度多态, 0.25＜PIC＜0.5为中度多态, PIC＜0.25为低度多态[33]。本研究中长沙草鱼、安庆草鱼、嘉兴草鱼、靖江草鱼、石首草鱼、松江草鱼、瑞昌草鱼、邗江草鱼和红草鱼9个群体的平均等位基因数(Na)为 2.56—5.33, 平均期望杂合度(He)为 0.4696—0.7129, 平均多态信息含量(PIC)为 0.3949—0.6582, 除红色草鱼突变群体外, 9个长江水系的原种或自繁群体均表现为较高的多态性； 红色草鱼突变群体的遗传多样性最低(平均Na、He和PIC依次为2.56、0.4696和0.3949), 表现为较低的遗传多样性, 这可能与红色草鱼原始突变亲本较少和存在一定的近亲交配有关。

利用UPGMA 法对这9个草鱼群体进行聚类分析, 其中, 安庆群体和松江群体首先聚为一支, 瑞昌群体和邗江群体聚为一支, 然后这两支聚为一支后又与嘉兴群体聚为一支； 靖江群体和石首群体聚为一支, 这支再与前一大支聚类； 最后与长沙群体聚类。其中红色草鱼群体单独聚为一支, 与其他8个群体遗传距离较大, 与长沙群体的遗传距离最远。由于红色草鱼群体远离长江水系, 而其他8个群体均属于长江水系, 地理隔离导致了红色草鱼群体产生了较大偏离。而在同属于长江水系的8个草鱼群体中, 长沙群体与其他7个群体遗传距离较远, 可能是因为长沙群体的主要生活水域为洞庭湖, 洞庭湖水域相对稳定, 流动性较小, 久而久之就与长江干流群体产生了分化, 而长江干流群体因流动性大, 基因交流程度大, 所以其遗传相似性大。总的看来, 所有长江水系群体的遗传距离与其地理距离也不尽相符, 这可能与取样的随机性有关, 不同江段的样本自身也存在差异, 可能还和所用的微卫星引物及研究所用样本的数量有关, 因为标记数和样本数量对遗传参数的影响很大[34]； 另外, 不同地域之间草鱼的人工迁移可能也对研究结果有影响。

3.3 红色草鱼突变体的产生原因及意义

体色是鱼类的一个重要表型性状, 体色变异在遗传学、育种学以及功能基因发掘方面有着重要的研究价值。鱼类的不同体色与其体内色素细胞(黑色素细胞、虹彩细胞等)直接相关[35]。而硬骨鱼类色素细胞合成色素时受神经和内分泌的调控。Fujii等[36]研究发现, 释放儿茶酚胺的神经原控制脑垂体分泌促黑色素细胞生成激素, 进而影响体色。肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺等儿茶酚胺是应激时调控鱼类体色变化的主要激素, 而酪氨酸酶则是黑色素生成的关键酶, 酪氨酸酶的含量和活性较高的部位体色较深。本研究中的草鱼红色突变体, 体表鳞片和鳍均呈淡红色, 且经过一年的养殖之后体色并没有变化, 应属于不可逆性突变。所以, 黑色素主控基因酪氨酸酶基因的突变或者酪氨酸酶在体内受到抑制可能是草鱼红色突变体产生的根本原因。

目前, 鱼类等生物优良品种选育的一个主要途径就是发现并利用自然突变体, 然后通过继续选育来强化和稳定优良的突变基因, 也可用杂交的方法将突变体的优良基因整合到我们所需要的目标鱼体当中。从本质而言, 这均是利用自然界已存在的携带优良性状基因的突变体, 在此基础上加以选择、固定, 从而建立优良品系； 因此, 携带优良性状突变体的获得对鱼类基因库的扩展及缩短育种年限具有重要意义[37]。

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DETECTION OF EST-SSRS MARKERS AND GENETIC STRUCTURE OF DIFFERENT POPULATIONS OF GRASS CARP IN YANGTZE RIVER SYSTEM

ZHENG Guo-Dong, CHEN Jie, JIANG Xia-Yun and ZOU Shu-Ming
(Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this study, we selected 181 microsatellite loci from 2400 EST sequences to perform germplasm identification and genetic diversity analysis in different regions of grass carp, Ctenopharyngodon idella. Nine pairs of primers, which could give stable and polymorphic amplification profiles, were screened out from 46 microsatellite loci and used to analyze the genetic structure of C. idella. The 9 pairs of primers were used to analyze the genetic structure of 8 populations of the Yangtze River (CSC, AQC, JXC, JJC, SSC, SJC, RCC and HJC) and 1 red population (HC). The mean value of number on alleles (Na) of CSC, AQC, JXC, JJC, SSC, SJC, RCC, HJC and HC was 4.67, 5.22, 5.33, 5.00, 4.89, 4.78, 4.89, 4.67 and 2.56, respectively. The mean value of expected heterozygosity (He) was 0.6397, 0.6543, 0.6831, 0.6356, 0.6737, 0.6483, 0.6664, 0.7129 and 0.4696, respectively. And the average value of polymorphism information content (PIC) was 0.5787, 0.6126, 0.6283, 0.5894, 0.6217, 0.5956, 0.6136, 0.6582 and 0.3949, respectively. It demonstrated that the genetic diversity of HJC was the highest and HC was the lowest among the nine populations. Using unweighted pair-group method with arithmetic means method (UPGMA) based on their genetic distances, the cluster analysis in nine populations showed that 8 populations of the Yangtze River first grouped together, then they clustered with the red population. In addition, the genetic distance between AQC and SJC was 0.0725, which was the nearest, the genetic distance between HC and CSC was 0.5217, which was the farthest. Our results will have important value in germplasm resources preservation, germplasm identification and breeding of C. idella.

Grass carp； EST-SSR； Genetic structure； Yangtze River system

Q346+.5

A

1000-3207(2015)05-1003-09

10.7541/2015.131

2014-07-14；

2015-04-12

“十二五”国家863计划主题项目(2011AA100403)； 公益性行业(农业)科研专项(200903045)； 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心(2F1206)资助

郑国栋(1987—), 男, 山东潍坊人； 硕士； 主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail: zgdong.521@163.com

邹曙明, Tel: 021-61900345； E-mail: smzou@shou.edu.cn