张　震，徐　盼，张　慧，段艳宇

(江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室，江西南昌330045)



VRTNPromoter-hsp68-LacZ表达载体的构建与鉴定

张震，徐盼，张慧，段艳宇*

(江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室，江西南昌330045)

摘要：利用β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因对与猪脊椎发育相关的VRTN基因调节突变区进行研究和鉴别。使用通路克隆技术构建与VRTN基因的启动子区与热休克蛋白(hsp68)启动子及LacZ相连的报告载体，将其转染人肾上皮细胞系(HEK293T细胞)，并将载体线性化后整合入HEK293T细胞基因组中进行上述表达质粒整合效率的评估。结果表明：利用通路克隆技术构建真核表达质粒快速准确；在脂质体介导下转染HEK293T细胞后，将细胞置于42 ℃热休克染色后检测转染效率60%左右；线性化后转染HEK293T细胞加新霉素G418筛选后可得到稳定遗传的整合有质粒的细胞。

关键词：通路克隆；VRTN基因；热休克蛋白；表达载体

猪脊椎数是重要经济性状，与胴体长和产肉率成正相关，在育种上具有重大意义，每增加一根脊椎可增加体长30 mm及单位产肉效率。中国地方品种的胸腰椎总数为19根，欧洲商业猪种为21～23根[1-3]。这种脊椎数的变异主要受遗传的影响，它具有较高的遗传力。现已鉴别到影响猪胸椎数的位置候选基因VRTN2个调节突变在西方商品猪和中国地方猪种都存在强相关。本实验室前期构建了大规模白色杜洛克×中国地方猪二花脸F2资源群体，测定了1 029头F2屠宰个体的脊椎数表型，通过全基因组扫描共检测到了12个影响猪脊椎数的QTL[4]。其中，对于7号染色体上的主效QTL进行精细定位发现g.20311_20312ins291和g.19034A>C 2个位点符合因果突变的条件且高度连锁[5-6]。该项成果已经应用到国内种猪选育当中。后期通过序列比对发现g.20311_20312ins291和g.19034A>C位于VRTN转录起始位点±3 000 bp内，2个突变位点在潜在的启动子区，可能对于VRTN的转录起始效率有作用。

脊椎是通过体节期的胚胎的分节、体节的融合和分化、分别发育成颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎。因此，g.20311_20312ins291和g.19034A>C突变是否引起VRTN表达量的差异需在胚胎相应时期进行检测。然而，对于猪基因启动子在早期胚胎发育是否有功能的检测方法目前未见报道。因此，建立一套可用于检测猪胚胎发育关键基因启动子、增强子和抑制子等功能元件的鉴别方法，对于猪胚胎早期发育及后期宫内营养不良的研究具有重要意义。LacZ基因通常作为外源功能元件在小鼠早期胚胎发育是否有功能的指示基因，用作评估功能元件对于基因表达的作用[7]。本研究是首次利用LacZ报告基因对于猪基因的潜在调节突变功能进行研究，对于今后对猪组织特异性增强子的鉴别具有参考意义，探索利用通路克隆技术建立一套高效的可用于对早期胚胎发育关键基因功能元件鉴别的分子克隆手段。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌株和细胞系pGL4.20-VRTNpromoter质粒，pENTR-D-TOPO质粒购自Invitrogen公司，hsp68-LacZ质粒来自Addgene机构。实验中所有使用的菌株均为trans-5α，购自北京全式金公司。人肾上皮细胞系(HEK293T)由江西农业大学动物生物重点实验室保存。

1.1.2试剂高保真PCR酶(deepvent)、限制性内切酶HindⅢ、NdeⅠ购自NEB公司，DNA maker来自Takara公司，割胶回收试剂盒、DNA回收试剂盒和小抽中量质粒提取试剂盒购自天根公司，X-gal染色试剂盒为Sigma公司产品，LR ClonaseTMII 酶、BP clonase、蛋白酶K、lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，细胞培养所用的DMEM、青霉链霉素、胎牛血清、OPTI-MEM培养基、新霉素(G418)均为Gicbo公司产品。本实验中所有引物由上海生工公司合成。

图1　通路克隆技术构建VRTN Promoter-hsp68-LacZ表达载体Fig.1　The gateway cloning technology construct VRTN Promoter-hsp68-LacZ expression vector

1.2方法

1.2.1设计VRTNPromoter-hsp68-LacZ真核表达载体的构建路线图根据通路克隆技术BP反应和LR反应的原理，设计出构建VRTNPromoter-hsp68-LacZ真核表达载体路线图。首先获得VRTNPromoter目的片段，利用BP反应插入到pENTR-D-TOPO质粒中，然后再利用LR反应将VRTNPromoter置换到hsp68-LacZ质粒中，完成最终VRTNPromoter-hsp68-LacZ载体的构建。如图1所示。

1.2.2VRTNPromoter片段的获得与纯化根据构建路线图，利用PCR法将pGL4.20-VRTN质粒上的VRTNPromoter片段扩增出来。体系为40 μL，50 ng/μL pGL4.20-VRTN质粒DNA 2 μL，1.0 mmol/L MgCl22.5 μL，0.2 mmol/L dNTP 1 μL，0.2 μmol/L前引1 μL，0.2 μmol/L后引1 μL，deep vent Taq 2.5 μL，buffer 4 μL,双蒸水26 μL。PCR程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，共28个循环。前引序列为GGAAAGCCTATGGGGATGGGGTAGAG；后引序列为TTCCCCCAGGAGGTAAGAGAAGTTCC。使用1%琼脂糖凝胶电泳割胶、1 kb marker 确定目的片段位置，目的片段为2 kb。在紫外灯下割胶纯化PCR片段，按照天根公司的割胶纯化试剂盒回收纯化目的片段。

1.2.3入门克隆(entry clone)的获得利用购自Invitrogen公司的pENTR-D-TOPO试剂盒获得入门克隆。反应体系为6 μL，分2个EP管，PCR产物VRTNPromoter (150 ng/μL)各4 μL，无菌水各1 μL，pENTR-D-TOPO(150 ng/μL)各1 μL，室温孵育2 h。反应结束后将反应产物于冰上转化感受态trans-5α。按照全式金公司提供的转化trans-5α感受态标准流程进行操作并对长出的菌落进行阳性鉴定。体系为25 μL，菌液2 μL，1.0 mmol/L MgCl21.5 μL，0.2 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.2 μmol/L前引0.5 μL，0.2 μmol/L后引0.5 μL,Taq酶0.5 μL，buffer 2.5 μL，双蒸水17 μL。PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。前引序列为：GGCAGGGAAGGTGTTTGTTA后引序列为：GACTGGCCTCTGTCCCTTG。1.5%琼脂糖凝胶电泳，50 bp DNA maker确定目的条带，目的条带为420 bp。确定阳性菌落后扩大培养，按照天根公司的小抽中量质粒提取试剂盒说明书提取入门质粒。

图2　VRTN Promoter-hsp68-LacZ质粒图Fig.2　VRTN Promoter-hsp68-LacZ plasmid map

1.2.4表达质粒的获得按照Invitrogen公司LR反应试剂盒说明书，LR反应体系为8 μL，入门质粒1 μg，hsp68-LacZ质粒500 ng，用Tris-EDTA(pH 8.0)缓冲液将体系补充至8 μL。向反应液中加入2 μL LR ClonaseTMⅡ酶混合物，并通过2次短暂的漩涡震荡(每次2 s)，将其混合均匀并进行短暂的低速离心(short，<3 000 r/m)。后将反应体系25 ℃孵育1 h。最后向每份样品中加入1 μL蛋白酶K溶液终止反应。稍微震荡，在37 ℃下孵育样品10 min。将反应液置于冰上转化trans-5α感受态并对长出的菌落进行阳性鉴定。

为了确保VRTNPromoter片段插入方向的准确性，做阳性鉴定时设计了1对跨VRTNpromoter与LacZ的引物。阳性鉴定体系为25 μL，菌液2 μL，1.0 mmol/L MgCl21.5 μL，0.2 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.2 μmol/L前引0.5 μL，0.2 μmol/L后引0.5 μL，Taq酶0.5 μL，buffer 2.5 μL，双蒸水17 μL，PCR程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s共35个循环。前引序列为：CCATGAGGTTGCGGGTTC后引序列为：AATCTTCCAGCAGTTTCGCG。1.5%琼脂糖凝胶电泳，50 bp DNA maker确定目的条带。目的条带为898 bp。确定阳性菌落后扩大培养并获得质粒后送上海生工公司测序。最终获得的载体如图2所示。

1.2.5VRTNPromoter-hsp68-LacZ转染HEK293T细胞复苏HEK293T细胞，并传代到6孔板，生长至汇合度为80%左右时，用于转染。采用脂质体转染方法进行转染。转染前2 h换培养基。使用245 μL OPTI-MEM培养基稀释总量为5 μg表达质粒,同时使用245 μL OPTI-MEM培养基稀释5 μL lipofectamine2000，室温静置5 min。将两溶液轻轻混匀后室温孵育20 min。将复合物共500 μL加入到每孔细胞中。VRTNPromoter-hsp68-LacZ转染两孔，一孔为空白对照。

1.2.6VRTNPromoter-hsp68-LacZ线性化后整合入HEK293T细胞中根据VRTNPromoter-hsp68-LacZ质粒的特点设计限制性内切酶HindⅢ将表达质粒线性化。酶切体系为40 μL，1 000 ng/μL表达质粒20 μL，限制性内切酶HindⅢ4 μL，10×buffer 4 μL，10×BSA 4 μL，无菌水至8 μL，于37 ℃酶切8 h。线性化后的质粒按照天根公司的DNA回收试剂盒回收质粒。线性化后的VRTNPromoter-hsp68-LacZ质粒转染293T细胞。转染10 h后换液，24 h后换上加有800 ng/mL新霉素的完全培养基，以后每隔24 h后换液，连续培养1周。

1.2.7β-半乳糖苷酶细胞化学染色染色前先将细胞置于42 ℃培养2 h后37 ℃培养1 h，再进行染色。表达质粒中带有LacZ标记基因，要判断质粒是否转入细胞或者质粒是否整合入细胞基因组可用β-半乳糖苷酶组织化学染色法鉴别。按照Sigma公司β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书中步骤对细胞进行染色。染色后用显微镜观察并用照片记录。

2结果与分析

2.1VRTNPromoter-hsp68-LacZ真核表达质粒的构建与鉴定

经过通路克隆技术中的第一步BP反应后形成入门克隆再通过LR反应得到最终的表达载体。VRTNPromoterhsp68-LacZ载体全长10 kb左右,主要由VRTNPromoter、hsp68 promoter、LacZ基因和氨苄青霉素筛选基因组成。LacZ基因受这2个启动子调控，任一个均能驱动其表达。VRTNPromoter-hsp68-LacZ真核表达载体PCR鉴定结果如图3所示。结果显示PCR条带单一，VRTNPromoter目的条带为2 173 bp，与预期相符，而对照组的hsp68-LacZ则扩增不出VRTNPromoter目的片段，说明VRTNPromoter已经插入至hsp68-LacZ载体中。为了确保VRTNPromoter片段插入方向的准确性，又进行了插入方向的PCR鉴定，结果如图4所示。

1:VRTN Promoter-hsp68-LacZ的PCR图;2：hsp68-LacZ的PCR图M：Maker1:PCR identification with VRTN Promoter-hsp68-LacZ;2:PCR control with hsp68-LacZ M:Maker图3　VRTN Promoter-hsp68-LacZ PCR鉴定Fig.3　PCR identificationfor VRTNPromoter-hsp68-LacZ

1:VRTN Promoter正向插入LacZ的PCR图;2:hsp68-LacZ的PCR图M：Maker1:PCR identification with VRTN Promoterforward toinsert the LacZ;2:PCR control with hsp68-LacZ M:Maker图4　VRTN Promoter正向插入LacZ PCRFig.4　PCR identification for VRTN Promoterforward to insert the LacZ

结果显示目的条带单一为898 bp，而对照组的hsp68-LacZ则扩增不出目的片段，说明VRTNPromoter已正向插入hsp68-LacZ中，保持了阅读方向的正确性。这些结果初步表明VRTNPromoter已正确插入hsp68-LacZ载体中。将抽提的质粒送上海生工公司测序，测序结果证明质粒构建正确。

2.2VRTNPromoter-hsp68-LacZ转染HEK293T细胞

VRTNPromoter-hsp68-LacZ载体转染HEK293T细胞结果如图5所示。结果显示VRTNPromoter-hsp68-LacZ载体转染效率60%左右，在42 ℃热击后启动了LacZ的表达，说明该环状载体功能正常，可以正确表达β-半乳糖苷酶。

图5　VRTN Promoter-hsp68-LacZ质粒转染HEK293T细胞染色图与对照组Fig.5　VRTN Promoter-hsp68-LacZ was transfected into HEK293T cells and the control group

2.3线性化VRTNPromoter-hsp68-LacZ载体整合HEK293T细胞

线性化VRTNPromoter-hsp68-LacZ质粒利用脂质体介导转染，并用新霉素一周筛选后整合入HEK293T细胞中在20倍镜和40倍镜下观察。结果如图6所示：经新霉素筛选后未整合有质粒的细胞相继死亡，最后只有整合有线性质粒的HEK293T细胞存活下来且可以分裂繁殖。

图6　线性化VRTN Promoter-hsp68-LacZ质粒整合入HEK293T细胞染色Fig.6　The linearized VRTN Promoter-hsp68-LacZ plasmid integration into HEK293T cells

3结论与讨论

本研究表明利用通路克隆技术可快速准确构建VRTNPromoter-hsp68-LacZ质粒，这可为大量构建连有多个报告基因的质粒提供参考。线性化VRTNPromoter-hsp68-LacZ整合入HEK293T得到稳定表达的细胞。这是首次利用LacZ报告基因研究猪位置候选突变对下游基因表达时间和区域的作用，该研究可为今后鉴别猪因果突变所需功能验证奠定理论基础。

脊椎是由胚胎早期体节处的生骨节细胞围绕脊髓和脊索形成的[8]，而脊椎的数量是由体节的数量所决定。因此，对于猪脊椎数位置候选基因VRTN调节突变是否引起该基因在体节发生区高量表达是论证g.20311_20312ins291和g.19034A>C是因果突变、VRTN是控制脊椎数因果基因的必需证据之一。本研究中将携带有2个候选突变的片段插入到热休克蛋白hsp68启动子上游。Hsp68启动子在热诱导条件下可在胚胎期任一阶段、任一细胞表达lacZ基因，而在正常生长条件下无表达[9]。因此，在未诱导条件下，LacZ的表达量由上游插入片段决定。VRTNPromoter-hsp68-LacZ质粒转染293T细胞后，正常培养条件下无LacZ表达。部分论证了g.20311_20312ins291和g.19034A>C可引起VRTN在猪胚胎非广谱而是组织特异性表达。而且该质粒在新霉素筛选下，线性化质粒整合入细胞基因组的效率高，说明该质粒注入原核期受精卵后可有效整合入受精卵基因组。我们随后的实验也证明将该质粒注入200枚原核期受精卵后，产生了6只阳性小鼠(结果待发表)，证明该质粒构建转基因动物产生阳性小鼠的概率较高。

猪因果突变鉴别过程中，对于位置候选突变功能的解析是鉴定它是否是因果突变的必需条件。然而，至今对于猪胚胎期位置候选突变的功能解析仍很困难，现今鉴别因果突变通用流程GWAS和精细定位联合分析将候选区域缩小到某一区域后，如果该区域包含一个结构性突变时因果突变的鉴定工作就相对容易。例如，Mikawa等利用3个猪群精细定位控制猪脊椎数的区域到300 kb后，通过搜寻该区域中的结构突变确定了已知功能的NCOR1基因一个功能结构域中脯氨酸到亮氨酸的突变对于蛋白功能很重要,一个新的因果突变和分子育种标记就此建立[10]。然而，当区域内没有结构性突变时整个鉴定过程就异常漫长，如经典调节突变IGF2的鉴定过程[11-12]。Mikawa等利用上述3个猪群精细定位猪7号染色体上控制猪脊椎数的区域到450 kb后,由于没有已知功能基因的结构性突变存在于此区域中，因果突变的搜寻不得不停滞[5]。Fan等虽然进一步缩小该区域到100 kb，但因果突变的鉴定也因没有有效的调节突变功能验证工作而停滞[6]。因此，建立一套行之有效的胚胎期因果突变功能鉴别的技术和流程对整个行业的分子育种工作都有促进作用。

本研究所用的通路克隆技术，是Invitrogen公司推出的一种克隆新策略。该技术是基于λ噬菌体与大肠杆菌间的位点特异性重组克隆机制[13](attB x attP →attL x attR)。通路重组克隆技术中只包含BP和LR 2个反应，BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体中。该技术省去了酶切连接等步骤，可实现简单快速的目的载体的构建。如果采用传统的酶切-连接基因克隆方法，不但整个实际的操作过程费时费力，而且需要根据不同的目的片段设计引入不同酶切位点的引物并更改相应试验流程。可见传统的克隆手段不适于大规模因果突变或组织特异性增强子的鉴别工作。因此，本研究所建立的大规模、高通量的高通克隆调节突变-hsp68启动子-LacZ报告质粒的技术对于今后开展猪组织特异性表达基因的时空性研究具有价值。

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Construction and IdentificationofVRTNPromoter-

hsp68-LacZ Expression Vector

ZHANG Zhen,XU Pan,ZHANG Hui,DUAN Yan-yu*

(State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045，China)

Abstract:In this study,β-galactosidase (LacZ) reporter gene was used to explore and identify the regulatory mutations of theVRTNgene which is associated with the spine development of swine.Here,a gateway compatible report vector that contains the promoter ofVRTNgene and heat shock protein (hsp68) promoter coupled to the β-galactosidase (LacZ) reporter gene was constructed by gateway cloning technology.Circle or linearized vector was transfected into human kidney epithelial cells (HEK293T).To evaluate integration efficiency of linearized vector,the number of G418-resistant colony formation was measured after the cells grew in medium supplemented with G418 for 1 week.The results show that gateway cloning technology is quick and accurate to constructVRTNPromoter-hsp68-LacZreporter plasmid;after LacZ stain,the blue cell dots were observed in 60% HEK293T cells after 42 ℃heat shock and some G418-resistant colonies indicated that the linearized vectors integrated into HEK293T cell genome.

Key words:gateway cloning;VRTNgene;heat shock protein;expression vector

作者简介：张震(1992—)，男，硕士生，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：1252735909@qq.com;*通信作者：段艳宇，讲师，E-mail：yanyuduan@hotmail.com。

基金项目：国家自然科学基金(31301950 )和江西省研究生创新专项资金项目(YC2014-S191)资助

收稿日期：2015-03-09 修回日期：2015-11-04

中图分类号：Q785

文献标志码：A

文章编号：1000-2286(2015)06-1080-06

张震，徐盼，张慧，等.VRTNPromoter-hsp68-LacZ表达载体的构建与鉴定[J].江西农业大学学报，2015，37(6)：1080-1085.