唐小梅，伍参荣，杜卓，杨维青，万学勤，朱春霞

（1.广东医学院基础医学院，广东东莞523808；2.湖南中医药大学医学院，湖南长沙410007；3.佛山科学技术学院药学系，广东佛山528000）

戊己丸水煎液对幽门螺杆菌感染SGC-7901细胞形态及凋亡的影响

唐小梅1，伍参荣2，杜卓3，杨维青1，万学勤3，朱春霞3

（1.广东医学院基础医学院，广东东莞523808；2.湖南中医药大学医学院，湖南长沙410007；3.佛山科学技术学院药学系，广东佛山528000）

摘要：目的在体外研究戊己丸水煎液对幽门螺杆菌诱导的SGC- 7901细胞形态及凋亡的作用。方法以SGC- 7901细胞作为幽门螺杆菌株感染的体外细胞模型，用不同浓度的戊己丸水煎液干预，倒置显微镜观察SGC- 7901细胞的形态；流式细胞仪分析胃上皮细胞SGC- 7901的凋亡百分率。结果戊己丸水煎液加入幽门螺杆菌感染的细胞后，受损细胞出现修复；不同浓度戊己丸水煎液均可以减少幽门螺杆菌诱导的SGC- 7901细胞的凋亡,与阴性对照组比较差异有显著性（p<0.05）。结论戊己丸水煎液能降低幽门螺杆菌感染的SGC- 7901细胞的凋亡率；对幽门螺杆菌感染的SGC- 7901细胞的形态有保护作用。

关键词：戊己丸水煎液；SGC- 7901细胞；幽门螺杆菌；凋亡

幽门螺杆菌（helicobacter pylori，H·pylori）与许多慢性胃部疾病，特别是与胃癌的发生密切相关。目前，H·pylori的感染居高不下，临床采用抗生素抑杀H·pylori已成为基本的治疗原则，但抗生素治疗带来耐药菌株等副作用，故寻找非抗生素疗法势在必行。

中成药戊己丸源自宋代《太平惠民和剂局方》，收录于中国药典2010版，是临床治疗消化性胃溃疡、胃炎的经典方剂。体外抑菌实验发现黄连、吴茱萸及戊己丸的水煎液均对H·pylori有明显的抑制作用［1］，但戊己丸防治H·pylori感染的机理尚不明确。本文通过体外试验探讨戊己丸对H·pylori感染所致胃部疾病的作用机理。

1　材料与方法

1.1材料

H·pylori悉尼国际标准菌株SS1（sydneystrain 1），湖南中医药大学伍参荣教授惠赠。

胃腺癌SGC- 7901细胞，本实验室冻存。

戊己丸水煎液，按原方比例称取药材，由广东医学院中药与新药研究所制备，浓度为1 g/mL。

布氏培养基、小牛血清来自青岛海博生物技术有限公司；无菌脱纤维羊血来自广州蕊特生物有限公司；RPMI1640培养液来自美国Gibcobrl；胰酶来自瑞士Roche公司；其余试剂为分析纯。

1.2方法

1.2.1H·pylori菌悬液的制备

在无菌条件下，将复苏的H·pylori菌均匀涂布于布氏羊血培养基平板上，于37℃微需氧环境下培养，3～5 d后收集针尖样透明菌落，用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液（不加双抗）作稀释液，将细菌的浓度调整为1×108CFU/mL。

1.2.2不同浓度戊己丸水煎液的制备

用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液（不加双抗）作稀释液，将戊己丸水煎液的浓度分别稀释为1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280。

1.2.3细胞培养及形态观察

首先在96孔细胞培养板上，采用常规培养基即RPMI 1640培养液加20%小牛血清及双抗，于37℃CO2培养箱培养，每周换液3次，待细胞铺满底后，用0.25%胰酶消化成单个细胞，继续培养，取对数生长期细胞进行实验。然后将稀释好的不同浓度的戊己丸水煎液和H·pylori菌悬液加入细胞中，药液每孔加180 μL，菌悬液每孔加20 μL，每孔液体体积200 μL，每个药液浓度重复8孔，在37℃微需氧条件下培养。24 h后，取出细胞培养板，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.4细胞凋亡的分析（流式细胞仪）

以1×105个/mL将细胞转种至小青霉素瓶，每瓶1 mL，于37℃CO2培养箱内培养，每周换液3次，选取长满单层且生长良好的的细胞进行实验。用Hank’S液清洗细胞2次，然后加入已经稀释好的不同浓度的戊己丸水煎液和H·pylori菌悬液，药液每瓶加0.9 mL，菌悬液每瓶加0.1 mL，每瓶液体体积1 mL，每个药液浓度重复8瓶，在37℃微需氧环境下培养。24 h后用70%乙醇固定22 h。固定好后，用PBS反复洗3次，细胞重悬于PI染液（PI终浓度为50 ug/mL）中，37℃孵育30 min进行流式分析。

1.2.5统计分析

采用统计软件SPSS11.5分析，测得指标都采用均数±标准差（x±s）表示。

2　结果

2.1戊己丸水煎液对H·pylori感染SGC-7901细胞形态的影响

不加细菌的SGC- 7901细胞在倒置显微镜下观察生长良好，呈多角形，贴壁生长，细胞之间连接紧密，如见图1所示。

加入H·pylori菌悬液感染后，细胞变圆，贴壁细胞减少，悬浮细胞增多，细胞周围出现碎片，细胞间的连接较少甚至消失，细胞核和细胞质之间分界模糊，呈现核质融合状态，观察到细胞坏死，如图2所示。

戊己丸水煎液加入H·pylori菌感染的细胞后，贴壁细胞和细胞间的连接明显增多，部分受损细胞出现修复如图3、4所示。

图1　正常SGC-7901细胞40×10细胞生长良好、呈多角形

图2　H·pylori感染SGC-7901细胞40×10细胞融合、发暗、变圆、坏死

图3　戊己水煎液浓度1︰160 40×10 无H·pylori细胞修复

图4　戊己水煎液浓度1︰320 10×10仍有细胞坏死、部分细胞修复

2.2戊己丸水煎液对H·pylori感染SGC-7901细胞凋亡的影响

在细胞中加入不同浓度的戊己丸水煎液和H·pylori菌悬液，培养后流式细胞仪分析SGC- 7901细胞凋亡百分率结果如表1所示。

表1　戊己丸水煎液对H·pylori感染SGC-7901细胞凋亡率的影响

表1显示，浓度为1∶160、1∶320、1∶640的戊己丸水煎液均可以减少H·pylori诱导的SGC- 7901细胞的凋亡，与阴性对照组比较差异有显著性（p<0.05）。

3　讨论

H·pylori感染与胃粘膜上皮细胞凋亡的关系是近年来的研究热点。细胞凋亡在调节机体发育、维持内环境的稳定以及抵御外界各种因素的干扰方面起着关键的作用，凋亡失控与包括肿瘤在内的许多重大疾病有着密切的联系［2-3］。胃癌的发生与多种因素有关，细胞周期及细胞凋亡调节失控是导致细胞过度增殖促进肿瘤发生的重要因素。实验中发现H·pylori可以诱导细胞凋亡率的增加，诱导细胞变圆、融合、坏死。加入不同浓度戊己丸水煎液后均可不同程度降低H·pylori感染SGC- 7901细胞的凋亡率，细胞形态出现修复现象。实验表明，戊己丸水煎液可能通过抑杀H·pylori，从而保护感染细胞不坏死，使凋亡率明显降低。

H·pylori感染诱导胃粘膜上皮细胞凋亡由Moss［4］等最先报道。本实验发现，H·pylori感染细胞的凋亡率随细菌密度增加而呈浓度依赖性升高的趋势，该结果提示SGC- 7901细胞发生的凋亡是由H·pylori感染直接诱导所致，其凋亡率与H·pylori的依从性关系呈浓度依赖性，这与Wagner［5］、Chen［6］等的报道相符。姚红［7］和吴莺等［8］的体外实验也表明，H·pylori感染能引起胃上皮细胞的凋亡。杨艺等［9-10］在体外观察到，当H·pylori高浓度作用于上皮细胞时，H·pylori的致细胞空泡毒作用和促细胞凋亡作用占优势，将可能使胃粘膜出现损伤，H·pylori以浓度依赖方式诱导胃上皮细胞凋亡，这一论点支持本实验的结果与推测。

本实验的研究结果显示，戊己丸水煎液对H·pylori感染的SGC- 7901细胞的保护，可能是通过抑杀H·pylori、抑制细胞凋亡而实现的。是否还有其他机制，还有待进一步深入的研究。

参考文献：

［1］唐小梅,伍参荣.戊己水煎液在体外对幽门螺杆菌的抑制作用［J］.中医药学刊, 2005, 23（4）: 703- 704.

［2］RUSCONI J C, HAYSR, CAGANR L. Programmed cell death and pathwayin Drosophila［J］. Cell Death Differ, 2000, 7（1）: 1063- 1070.

［3］SAVILLJ, FADOKV. Corpse clearance defines the meaningofcell death［J］. Nature, 2000, 407（6805）: 784- 788.

［4］MOSS S F, CALAMJ, AGARWAL B, et al. Induction of gastric epithetial apoptosis by Helicobacter pylori［J］. Gut, 1996, 48: 498- 501.

［5］WAGNER S, BEIL W, WESTERMAN J, et al. Regulation of gastric epithelial cell growth by Helicobacter pylori: evidence for a major fole ofapoptosis［J］. Gastroenterol, 1997, 113: 1836- 1847.

［6］CHEN G, SORDILLO E M, RAMEY W G, et al. Apoptosis in gastric epithelial cells is induced by Helicobacter pylori and accompanied byincreasd expression of BAK［J］. Biochem Biophys Res Comm, 1997, 239: 626- 631.

［7］姚红,王健,郝素珍,等.幽门螺杆菌对SGC- 7901细胞增殖凋亡及p27kipl表达的影响［J］.中华微生物学和免疫学杂志, 2009, 29（6）: 517- 521.

［8］吴莺,李翔,周红,等.幽门螺杆菌对胃癌细胞BGC- 823形态及凋亡相关基因表达的影响［J］.世界华人消化杂志, 2011, 19（17）: 1767- 1772.

［9］杨艺,邓长生,彭俊忠.幽门螺杆菌对体外培养的胃上皮细胞增殖与凋亡的影响［J］.中华微生物学与免疫学杂志, 2002, 22（1）: 10- 13.

［10］杨艺,邓长生,姚学军,等.幽门螺杆菌对胃上皮细胞系SGC- 7901细胞生长的影响［J］.中华消化杂志, 2001, 21（2）: 113- 114.

【责任编辑：任小平renxp90@163.com】

The influence of Wuji Pill Solution on morphology and apoptosis of SGC- 7901 cells infected with Helicobacter pylori in vitro

TANGXiao- mei1, WUCan- rong2, DUZhuo3, YANGWei- qing1, WANGXue- qin3, ZHUChun- xia3
（1. School of Basic Medical Sciences, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China; 2. Medical School, Hunan Universityof Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 3. Department of Pharmacy, Foshan University, Foshan 528000, China）

Abstract:Objective To investigate the effecte of Wuji Pill Solution on morphology and apoptosis of SGC- 7901 cells infected with Helicobacter pylori (H·pylori) in vitro. Methods H·pylori were introduced to the cells. Microscope was applied toobserve the morphologyand flowcytometrywas used toanalyze the extent ofapoptosis of cells infected with H·pylori. Results The morphology of cells infected with H·pylori was repaired with Wuji Pill Solution. The apoptosis of cells were lower than that of contrast group( p＜0.05). Conclution Wuji Pill Solution decreased the apoptosis rate of SGC- 7901 cells infected with H·pylori and protected the morphology of cells infected with H·pylori .

Keywords:Wuji Pill Solution; SGC- 7901 cell; Helicobacter pylori; apoptosis

作者简介：唐小梅（1973-），女，山西大同人，广东医学院讲师、硕士。

基金项目：湛江市科技攻关资助项目（2009C3101016）；广东医学院青年基金资助项目（XQ0713）；广东医学院面上基金资助项目（XK1445）；广东省自然科学基金资助项目（S2012040007298）

收稿日期：2014-11-04

中图分类号：R573.6

文献标志码：A

文章编号：1008- 0171（2015）04- 0067- 04