微囊藻群体内生黏伪鱼腥藻荧光特征及空间分布

2015-02-27庄惠如黄祖芳翁笑艳卢玮舒惠琳

水生生物学报 2015年3期

关键词：水华微囊蓝藻

庄惠如黄祖芳翁笑艳卢玮舒惠琳

(1. 福建师范大学生命科学学院, 福州 350007; 2. 福建师范大学医学光电科学与技术教育部重点实验室, 福州 350007; 3. 福州市环境监测站, 福州 350011 )

微囊藻群体内生黏伪鱼腥藻荧光特征及空间分布

庄惠如1黄祖芳2翁笑艳3卢玮1舒惠琳1

(1. 福建师范大学生命科学学院, 福州 350007; 2. 福建师范大学医学光电科学与技术教育部重点实验室, 福州 350007; 3. 福州市环境监测站, 福州 350011 )

水华是淡水水体富营养化进程中形成的一种现象,蓝藻水华产生的巨大生物量、藻毒素以及异味物质已对公共卫生、人体安全和水体生态系统构成了极大的威胁, 由此引起的水环境问题已成为国内外普遍关注的焦点。微囊藻属(Microcystis Kutz.)是主要的水华蓝藻生物, 在自然水体中, 该植体成微观或目力可见的胶群体。伪鱼腥藻属(Pseudanabaena Lauterborn)则是丝状体型的蓝藻。有研究表明, 伪鱼腥藻不仅是常见的水华蓝藻, 部分种类也是蓝藻毒素和异味化合物的生产者[1,2]。我们在调研福建省典型饮用水源地蓝藻水华发生状况的过程中发现, 一种极微小的黏伪鱼腥藻P. mucicola 常在水华爆发期间大量增殖, 并且常以内生的习性生活在微囊藻群体的胶被中。由于普通显微镜在分辨率和清晰度上的局限性, 多年来,在浮游植物种类鉴定和水体污染生物监测过程, 体型微小的P. mucicola 往往被忽略了。迄今为止, 有关黏伪鱼腥藻和微囊藻伴生的生理生态学研究也尚未见报道。

激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)是一种集激光、显微镜和计算机于一体的新型、高精显微镜系统。与其他显微镜相比, LCSM 不仅具有成像分辨率高、样品制片简单等优点, 在活细胞的动态观察、显微荧光图像处理、荧光定位定量分析、组织细胞的光学连续切片和三维结构重建等方面均具有明显的优势[3]。我们曾应用LCSM对几种海洋微藻结构的荧光图像、光谱特性等方面进行研究尝试, 并获得初步成效[4,5]。本文应用LCSM研究伪鱼腥藻在微囊藻群体中的空间分布及其荧光特性, 旨在进一步拓展LCSM 在微藻研究领域的应用范围, 为水华蓝藻的生理生态研究提供一种有效新方法。

1 材料与方法

1.1 水样采集与样品制备

水样于夏季取自福州山仔水库蓝藻水华聚集的表层水, 经光学显微镜观察, 并在形态学鉴定的基础上, 取活体微囊藻群体和游离生活的黏伪鱼腥藻个体, 直接滴在载玻片上制成临时水装片进行LCSM观察。

1.2 激光共焦扫描显微镜系统

采用 LSM510 型激光共聚焦扫描显微镜(德国Zeiss), 单光子激发光源, 波长为 488 nm Ar+激光器(美国相干公司), 最大输出功率 30 mW。物镜40×(NA=0.75)用于激发和采集光信号。实验设置合适的滤色片获得藻体的荧光图像。同时, 在Lambda 模式下, 通过软件附带的圈选工具, 测量随机选定的 10—20个藻细胞的荧光强度值, 统计不同细胞的平均荧光强度, 获得样品平均荧光强度与发射波长(500—714 nm)之间的二维荧光光谱。另外对微囊藻群体进行不同深度的逐层扫描, 每个群体扫描约35层, 每层厚度为1 μm, 将同一群体的系列扫描图像进一步三维处理后获得三维荧光图像。

2 结果

2.1 微囊藻群体内生伪鱼腥藻的形态学特征

微囊藻植体成熟时由许多小群体联合组成不规则网状或窗格状的团块, 群体胶被透明, 易水化或坚实[6]。镜检观察发现, 不同种类的微囊藻胶被中, 常见一种个体极微小的短丝体蓝藻附生或内生(图版Ⅰ-1—3)。此外, 水体中还有一定数量的游离生活个体, 表明该蓝藻的生活习性可能以内生为主, 兼性浮游。该蓝藻丝体多由 3—6个细胞构成, 直或稍有弯曲, 不具胶鞘, 细胞横壁处有收缢或不明显, 细胞长大于宽, 圆柱形, 宽约 0.5—0.8 µm,原生质体均匀, 不具气囊。根据Anagnostidis & Komárek的蓝藻分类系统[7]上述微囊藻群体内生的蓝藻初步鉴定为黏伪鱼腥藻 Pseudanabaena mucicola (Naumann & Huber-Pestalozzi) Schwabe。

镜检结果发现, 不同种类的微囊藻群体中, 伪鱼腥藻内生程度不一。其中, 胶被明显但易水化的铜绿微囊藻(M. aeruginosa)和细胞排列疏松的史密斯微囊藻(M. smithii)群体中内生的伪鱼腥藻数量较多。胶被宽厚坚实的惠氏微囊藻(M. wesenbergii)群体中内生的伪鱼腥藻较少。而胶被不明显的鱼害微囊藻(M. ichthyoblabe)以及细胞排列比较密实的水华微囊藻(M. flosaquae)群体中则少见伪鱼腥藻附生。

2.2 微囊藻群体内生黏伪鱼腥藻及游离个体的自发荧光图像及其光谱

为了证实微囊藻群体内生短丝体及其游离个体的蓝藻属性, 应用共聚焦扫描显微镜分别收集水样中不同个体的荧光信号。图Ⅰ-4—5是在 LSCM 中, 用 488 nm Ar+激光激发获得的微囊藻群体内生黏伪鱼腥藻和游离个体的自发荧光图像。微囊藻和黏伪鱼腥藻均是原核生物,细胞原生质体均匀, 没有叶绿体等细胞器结构。所以, 由激光激发藻细胞内分散的色素物质发出的红色荧光使藻体形态清晰可见。

图1a是在Lamda模式下, 随机选取20个游离个体收集荧光信号获得的平均荧光光谱图。由图 1a可知, 游离生活黏伪鱼腥藻的自发荧光在500—714 nm 范围内有 2个明显的主峰, 其中小高峰位于580 nm 处, 此为蓝藻藻红蛋白(C-PE)的特征峰[8]; 最高峰出现在661 nm, 是别藻蓝蛋白(APC)的荧光峰; 在 682 nm处还有一个不明显的肩峰, 其归属于藻胆体中末端发射体(APC-B)和叶绿素 a的荧光峰。藻胆蛋白是蓝藻、红藻及隐藻门的捕光色素蛋白, 包括三大类即藻蓝蛋白(PC, λem 650 nm)、别藻蓝蛋白(APC, λem 660 nm)和藻红蛋白(PE, λem 577 nm)[9,10]。蓝藻细胞主要含蓝色的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白, 故藻体多呈蓝绿色。上述结果表明, P. mucicola细胞不仅含有藻蓝蛋白, 还含有藻红蛋白。此结果与文献中有关伪鱼腥藻种类具有藻红蛋白的报道[11]相吻合。

图1b是随机选取群体中微囊藻和内生黏伪鱼腥藻的20个细胞收集荧光信号, 分别获得微囊藻和内生黏伪鱼腥藻的荧光光谱图。由图1b可知, 群体内生黏伪鱼腥藻的自发荧光除了在 575 nm 处有一小高峰外, 在 650 nm (PC特征峰)处出现一高峰后, 谱线继续走高(661 nm、671 nm)至682 nm达到最高峰。和游离生活个体的光谱相比, 群体内生伪鱼腥藻的 PE荧光峰由 580 nm偏移至575 nm, 最高峰移至682 nm处。此外, 在650—682 nm之间, 由于PC、 APC、APC-B和 Chl. a的荧光发射峰彼此接近, 因此形成一个宽大并平缓走高的峰形。显然,群体内生的细胞与游离生活的个体在荧光光谱上存在一定差异。

图1 微囊藻群体内生伪鱼腥藻及游离个体自发荧光光谱Fig. 1 The autofluorescence spectra of endogenous P. mucicola in mucilage of Microcystis and free P. mucicola

比较图1b中黏伪鱼腥藻和微囊藻的自发荧光光谱还可知, 微囊藻没有PE峰(575 nm), 但在650—682 nm也同样呈现一个宽大并平缓走高的荧光峰。此外, 从荧光强度上看, 内生黏伪鱼腥藻在 650—682 nm的峰值均高于微囊藻的。此结果显示, 黏伪鱼腥藻和微囊藻在捕光色素构成上也有明显差异。

2.3 黏伪鱼腥藻在微囊藻群体中空间分布的荧光分析

利用 LSCM 对微囊藻群体进行不同深度的逐层扫描,结果显示, P. mucicola 多数内生在微囊藻群体外部的胶被中, 部分个体可深入群体内部, 但数量较少(图版Ⅰ-6—11)。

图2a是在Lamda模式下, 分别选取群体边缘和中部内生的黏伪鱼腥藻各10个个体, 用488 nm Ar+激光激发获得的平均荧光光谱。由图 2a可以看出, 不同部位内生的黏伪鱼腥藻细胞的荧光光谱峰形是一致的, 但荧光峰值存在一定差异。位于中部的黏伪鱼腥藻细胞较边缘的具有相对较高的荧光峰值。进一步对光谱中主要荧光峰的比较结果表明(图 2b), 群体中部内生的黏伪鱼腥藻比分布群体边缘的个体具有相对较高的PE/PC值, 而Chl. a/PE值则较低, Chl. a/PE值差异不明显。此结果表明, 位于群体中部的黏伪鱼腥藻其藻红蛋白可能含量较高。

图2 群体中不同部位伪鱼腥藻自发荧光光谱比较Fig. 2 The compare of autofluorescence spectra of endogenous P. mucicola in different parts of colony

3 讨论

伪鱼腥藻隶属于蓝藻门, 颤藻目, 伪鱼腥藻科。形态上与伪鱼腥藻比较相近的蓝藻是泽丝藻属(Limnothrix Meffert)种类。但后者藻丝横壁处不收缢, 细胞多具气囊[7]。国外对伪鱼腥藻的研究除了传统的形态分类, 生理生态外, 还涉及分子生物学、异味物质及毒性生理等。近年来,国内在湖库浮游植物的调查中, 伪鱼腥藻种类时有报道,但少有针对伪鱼腥藻的研究。潘双叶等[11]曾对亭下水库伪鱼腥藻的昼夜垂直变化进行研究, 但未确定其种类名称。在光学显微镜下, 黏伪鱼腥藻不仅体型微小, 体色也多呈透明勻质状态。在生态习性上, 黏伪鱼腥藻喜内生在其他浮游蓝藻群体胶被中。因此, 以往的浮游生物调查过程, 容易把微囊藻群体中内生的黏伪鱼腥藻归属到细菌等微生物范畴。本研究利用 LSCM观测活体材料的便利性, 并根据荧光光谱特征, 可以判断这种内生的丝状体为蓝藻种类。进一步根据其藻丝短, 横壁有收缢以及无气囊等形态学特征, 基本可以确定其分类属性。虽然黏伪鱼腥藻分布广, 数量大, 但国内的相关报道却极为有限。造成文献检索不到的原因, 除了体型微小, 易被忽略外, 可能还与分类鉴定所使用的分类系统不一致有关。

本研究发现, 在水华发生期间, 不同种类的微囊藻或多或少均有黏伪鱼腥藻殖入性内生或附生其群体的胶质中。显然, 群体胶被的厚薄、质地是影响黏伪鱼腥藻内生数量多寡的主要因素。本研究还发现, 黏伪鱼腥藻的生活习性是以内生为主, 兼性浮游, 在细胞密度上有时可成为水华的次优势种。在浮游植物数量周年变化的调查过程, 还发现, 微囊藻和黏伪鱼腥藻在数量上存在某种对应关系(结果另文报道), 此也映证了二者的伴生关系。

本文首次应用激光共聚焦扫描显微术, 针对黏伪鱼腥藻的荧光光谱特性进行研究。结果发现, 黏伪鱼腥藻细胞不仅含藻蓝蛋白也具有藻红蛋白。Silvia等[8]曾对 28株伪鱼腥藻进行表型与基因型的研究, 结果表明, 约占63%的种类, 其细胞中既含有藻蓝蛋白也有藻红蛋白。Kling等[12]对一种红色伪鱼腥藻的研究结果发现, 该藻体颜色在低光强条件呈红色, 暴露在高光下则变成绿色,并推断藻红蛋白的存在与其色适应能力有关。Silvia等[8]的光谱分析也表明, 不同光质条件下伪鱼腥藻的吸收光谱中, PE/PC和Chl. a/PC的比率存在差异。本研究结果显示, 游离生活的黏伪鱼腥藻个体与群体内生的细胞在荧光光谱上既有共性又存在一定差异。二者均具有 PE峰,但前者的最高荧光峰来自APC, 后者的PC、APC和Chl. a均有较强的荧光发射。此外, 群体内不同部位藻细胞的荧光光谱峰形一致, 但荧光峰值发生变化, 尤其是PE/PC和Chl. a/PC比率的不同显示其色素含量的变化。究其原因, 笔者认为, 微囊藻群体胶被的存在是产生差异的重要原因, 由于光线透入群体胶被时产生的强弱变化, 可能导致藻细胞在捕光色素构成、含量以及光能传递效率上的变化。本研究结果为伪鱼腥藻的色适应能力提供了佐证。

此外, 本研究还利用 LSCM 的连续光切片方法, 对自然状态下的微囊藻群体进行逐层扫描, 成功获得黏伪鱼腥藻在微囊藻群体中的空间分布信息, 这不仅为黏伪鱼腥藻与微囊藻相互关系的进一步研究提供重要依据,也为水华蓝藻的形态学和微观生态研究提供了一种便捷而有效的方法。鉴于黏伪鱼腥藻在蓝藻水华发生期间的数量之多, 进一步对该种的生理生态以及产毒与否进行深入研究尤显必要, 也极具现实意义。

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STUDY ON THE FLUORESCENCE SPECTRAL CHARACTERISTICS OF PSEUDANABAENA MUCICOLA AND SPATIAL DISTRIBUTION IN MUCILAGE OF MICROCYSTIS

ZHUANG Hui-Ru1, HUANG Zu-Fang2, WENG Xiao-Yan3, LU Wei1and SHU Hu-Lin1
(1. School of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 2. Key Laboratory of Opto-Electronic Science and Technology for Medicine, Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 3. Fuzhou Environmental Monitoring, Fuzhou 350011, China)

黏伪鱼腥藻; 微囊藻; 荧光光谱; 激光扫描显微术; 空间分布

Pseudanabaena mucicola; Microcystis; Fluorescence spectra; LSCM; Spatial distribution