张晓琴，张 晓，何晓锐，牛明杨，黄建新

(西北大学 生命科学学院，陕西 西安 710069)



·生命科学·

枯草芽孢杆菌YA-3对番茄早疫病的防治作用

张晓琴，张 晓，何晓锐，牛明杨，黄建新

(西北大学 生命科学学院，陕西 西安 710069)

从西洋参种植土壤中分离获得一株具有抗真菌活性的细菌YA-3，杯碟法测定表明，该拮抗菌对13种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，其中对番茄早疫病抑制率达82.2%；YA-3培养滤液可导致番茄早疫病病原菌菌丝畸变、枯萎或者断裂，阻碍菌丝生长，并能够抑制其孢子萌发，抑制率达92.3%以上；利福平抗性标记试验表明，YA-3在番茄叶片上有很强的定殖能力，第26 d仍能检测到该菌；经盆栽试验结果表明，YA-3发酵液可使番茄叶片发病率显著降低，防治效果可达到75.52%；根据其形态、生理生化特性及16S rDNA同源性分析结果，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

番茄早疫病；枯草芽孢杆菌；拮抗作用；生物防治

番茄早疫病又称轮纹病,由茄链格孢菌Alternariasolani引起,发生在叶、茎、叶柄及果实上,病害严重发生时可引起落叶、落果及断枝[1],该病对番茄产量的影响很大,生产上常年减产20% ～ 30%,严重时达50%以上,甚至绝产[2]。目前,生产上主要以化学药剂进行防治,但化学防治所带来的抗药性、农产品的农药残留以及环境污染等副作用已引起人们的高度重视[3-4],应用有益微生物对番茄早疫病进行生物防治变得十分重要。例如，印度Khan利用类芽孢杆菌B-30488r发酵液喷洒番茄叶面,使早疫病的发病率减少了45.3%[5],周防震从果实表面筛选出对番茄早疫病菌有拮抗作用的酵母菌,对3个品种的番茄早疫病平均抑制率达77.8 %[6]。本研究针对番茄早疫病病菌抗药性、化学防治的现状,从西洋参种植土壤中分离筛选到一株具有广谱抗真菌活性的拮抗细菌YA-3,研究其对番茄早疫病病原菌菌丝及孢子萌发的影响。在室外条件下利用抗利福平标记试验及盆栽试验初步探索该拮抗菌对番茄早疫病的防治效果,并通过形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析,对其进行了鉴定,以期为植物病害的防治提供新的高效生防菌株。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 拮抗细菌YA-3:分离自陕西留坝西洋参种植土壤,牛肉膏蛋白胨斜面保存于4℃。

供试植物病原菌:番茄早疫病(Alternariasolani)、甜椒早疫病(Alternariasolani)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)、马铃薯早疫病(Alternariasolani)、致甘薯干腐病(Fusariumsolani)、致轮纹病(Macrophoma)、番茄晚疫病(Phytophthorainfestans)、郁金香种球腐烂病(Trichodermasp.)、甜菜黑斑病(Alternariaalternata)、枣炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)、小麦赤霉病(Gibberellasaubinetti)、棉花枯萎病(Fusariumoxysporium)、西洋参立枯病(Rhizoctoniasolani),由陕西省微生物研究所提供。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基用于培养拮抗菌株,PDA培养基用于供试病原真菌的培养[7]。

1.2 抑菌谱的测定

将保存的拮抗菌YA-3在牛肉膏蛋白胨斜面上30℃恒温培养48 h进行活化,然后接种于其液体培养基中,150 r/min 30℃恒温培养48 h,即得发酵液,发酵液经8 000 r/min离心10 min,取上清经0.22 μm滤膜过滤得无菌发酵液。

采用杯碟法,将供试病原菌分别接种在PDA培养基中央,然后在离病原菌2.5 cm处十字交叉对称放置4个牛津杯,各向其中加入150 μL YA-3无菌发酵液,同时以加入150 μL无菌液体培养基作对照,恒温28℃培养,待对照组病原菌长满平皿时测量抑菌圈直径大小,按下式计算菌落生长抑制率,每个处理重复3次。

菌落生长抑制率(%)=

1.3 对番茄早疫病菌丝及孢子萌发的影响

1.3.1 对菌丝的影响 以番茄早疫病病原菌为指示菌,试验组参照1.2杯碟法,对照组仅接种番茄早疫病病原菌,28℃恒温培养5～6d后,分别挑取抑菌带边缘菌丝以及对照组菌丝,水浸片法制片,光学显微镜观察对比菌丝形态。

1.3.2 对孢子的影响 番茄早疫病孢子悬液的制备,即在已培养7 d的番茄早疫病平板上加入适量无菌水,洗下孢子并用0.45 μm滤膜过滤,除去菌丝,稀释制成1×105个/mL孢子悬液备用。无菌凹玻片上先滴加40 μL上述孢子悬液,再加入等量的YA-3无菌发酵液,盖上盖玻片,28℃保湿培养。以孢子悬液混合无菌液体培养基作为对照,每隔12 h随机检测100个孢子的萌发情况,计算孢子萌发抑制率。每组试验重复3次。

孢子萌发抑制率=(未萌发孢子数/检测孢子总数)×100%。

1.4 YA-3在番茄叶片上定殖动态研究

1.4.1 抗利福平标记菌株的筛选及其菌液制备采用抗药性标记法测定拮抗菌在番茄叶片上定殖动态,即先将YA-3培养液转入含l00 μg/mL利福平的牛肉膏蛋白胨平板上,30℃培养48 h。挑取长出的菌落,再将其转入含200 μg/mL利福平的牛肉膏蛋白胨平板上。依此方法直至筛选出能在含有400 μg/mL利福平的牛肉膏蛋白胨平板上正常生长,且菌落形态以及对病原菌的拮抗作用保持不变的利福平标记菌株,将其接入含400 μg/mL利福平的牛肉膏蛋白胨液体培养基中。在30℃ 150 r/min 培养48 h,稀释得1×l08cfu/mL发酵液备用。

1.4.2 菌株YA-3在番茄叶片的定殖 随机抽取同株龄盆栽番茄,设以下3组处理:第1组,均匀喷洒上述制得的YA-3发酵液;第2组,先喷洒YA-3发酵液,2 d后叶片接种1×105个/mL早疫病病原菌孢子悬液;第3组,番茄叶片先接种病原菌孢子悬液,叶片发病后(即2 d后),喷洒YA-3发酵液。以喷洒无菌液体培养基作对照,每组在处理后的0 d，2 d，5 d，8 d，12 d，16 d，18 d，20 d，22 d，24 d，28 d,随机抽取3片叶片,截取1 cm2叶片组织于无菌生理盐水中反复振荡漂洗,梯度稀释涂布于含400 μg/mL利福平的平板上,48 h后计数,每个处理设3个重复。

1.5 盆栽试验

盆栽番茄植株挑选生长状态近似、接近开花期植株进行以下4组处理:①对照组,只接种番茄早疫病病原菌孢子悬液;②70%(质量分数)百菌清1 000倍稀释液;③保护作用组,先均匀喷洒1×l08cfu/mL的YA-3发酵液,2 d后接种病原菌孢子悬液;④治疗作用组,先接种病原菌孢子悬液,2 d后植株发病时,均匀喷洒1×l08cfu/mL的YA-3发酵液。每组处理5株番茄植株,并设3次重复。接种番茄早疫病病原菌时先将叶片表面针刺,然后将1×105个/mL的病原菌孢子悬液喷洒于番茄叶表面,保湿培养14 d,随机抽取10片叶片,记录发病情况,计算病情指数、防治效果。病叶分级标准,以叶片病斑面积占整个叶面积的百分率来分级:0级,无病;1级,出现病斑,病斑的感染面积为叶面总面积的1/4以下;2级,出现病斑,病斑的感染面积为叶面总面积的1/4-1/2;3级,出现病斑,病斑的感染面积为叶面总面积的1/2-3/4;4级,出现病斑,病斑的感染面积为叶面总面积的3/4以上。

1.6 拮抗菌YA-3鉴定

1.6.1 形态及生理生化鉴定 菌株的形态特征及生理生化特性分析参照细菌鉴定的常用方法[8-9]。

1.6.2 分子生物学鉴定 采用酚/氯仿法提取菌株YA-3基因组总DNA,细菌通用引物Primer 1(27 F):5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和Primer 2(1495R):5′-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3′,进行16S rRNA全长扩增。PCR 反应体系(25μL)为: 2×Ex Taq Master Mix 12.5 μL,Primer 1和Primer 2各1 μL;Temple 1 μL;加ddH2O至25 μL。PCR反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min,共27个循环;最后72℃延伸5 min。反应结束后用1.5%(体积分数)琼脂糖凝胶电泳检测合格后,经北京奥科生物工程技术服务有限公司测序。

1.7 数据分析

试验数据采用统计分析软件SPSS18.0进行分析,不同处理间的差异显著性用Duncan氏新复极差法检验。

2 结果与分析

2.1 抑菌谱测定结果

杯碟试验结果表明,拮抗菌YA-3对供试的13种植物病原菌均有抑菌作用。其中，对番茄早疫病、甜椒早疫病及番茄灰霉病拮抗能力最强,对指示菌番茄早疫病抑菌圈直径达35.5mm,抑菌率达83.89%(见表1),且形成抑菌圈后继续培养12天抑菌圈大小不变。这表明该拮抗细菌具有拮抗能力强、抑菌谱广、抑菌性能稳定的特性。

表1 YA-3对供试病原真菌的抑制作用(平均值±标准差)Tab.1 The inhibition of YA-3 on pathogen fungal(Mean±SD)

2.2 对番茄早疫病病原菌生长的影响

与对照组相比,试验组病原菌菌丝异常,出现了溢缩,破裂的现象,有的部位还发生了畸变(见图1)。YA-3无菌发酵液对番茄早疫病病原菌孢子有明显的抑制作用(见图2)。对照组培养12 h孢子萌发正常,48 h孢子萌发长出芽管;处理组病原菌孢子培养12 h,孢子未能萌发,培养至48 h孢子仍不萌发或萌发的孢子出现畸形,孢子萌发抑制率达92.3%。这表明拮抗菌YA-3的代谢物能够导致菌丝、孢子畸形,抑制病原真菌菌丝生长及孢子的萌发。

图1 YA-3对番茄早疫病病原菌菌丝影响Fig.1 Effect of YA-3 on mycelium of tomato early blight pathogen

图2 YA-3发酵液对番茄早疫病病原菌抱子的影响Fig.2 Effect of YA-3 ferment liquid on spores of tomato early blight pathogen

2.3 菌株YA-3在番茄叶片的定殖动态

拮抗菌在植物叶片的定殖试验结果表明,第1组仅喷拮抗菌发酵液组,在26 d后检测不到拮抗菌YA-3的存在;第2组先喷拮抗菌发酵液组,YA-3在番茄叶片的定殖数目显著高于第1组,在第8 d到第12 d菌体数量较稳定,且第26 d仍能检测到其存在;第3组先接病原菌组,YA-3定殖数目最初阶段呈下降趋势,然后逐渐上升,在最大值处维持3 d后减少,可定殖18 d,而对照组检测不到拮抗菌(图3)。结果表明，先喷拮抗菌发酵液再接病原菌组拮抗菌YA-3的定殖时间及数量高于其他试验处理组,拮抗菌发酵液处理时间不同，对其在番茄叶片的定殖有显著影响。

图3 YA-3在番茄叶片上的定殖动态Fig.3 The colonization dynamics of YA-3 on phylloplane of tomato

2.4 室外盆栽试验

室外盆栽试验进一步证实该YA-3对番茄早疫病有较好的防治效果。由表2结果可见,处理14 d后,保护作用组,番茄早疫病发病率及病情指数分别为18.80%和12.42,防治效果显著高于治疗作用组及70%(质量分数)百菌清1 000倍稀释液,可达75.52%。70%(质量分数)百菌清1 000倍稀释液的防效与治疗作用组相当。结果表明，拮抗菌YA-3发酵液对番茄早疫病有一定的防治效果,对植株起到了一定的保护作用。

表2 YA-3对盆栽番茄早疫病的防治效果Tab.2 Control efficacy of YA-3 on potted tomato early blight

2.5 菌株YA-3鉴定结果

菌株YA-3在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养24 h,菌落呈圆形,中心凹,米黄色,表面较湿润,边缘整齐,菌体呈杆状,大小约3.4 μm×0.7 μm,革兰氏阳性菌,48 h后产生芽孢,芽孢中生。生理生化测定特征为接触酶、V-P反应阳性,吲哚阴性,可水解明胶、淀粉及酪素,利用柠檬酸盐,不利用丙酸盐,可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖且产酸。

测序结果显示,菌株YA-3序列长度为1455bp(GenBank登录号:KM497438,在NCBI数据库上进行BLAST比对。结果表明，该菌株与芽孢杆菌属菌株同源性最高,选取芽孢杆菌属9个模式菌株,用软件MEGA 5.0构建系统发育树,菌株YA-3与Bacilllus subtilis聚于同一分支中(图4)。结合形态学和生理生化特征及16S rDNA分析结果,将拮抗细菌YA-3鉴定为枯草芽孢杆菌Bacilllussubtilis。

图4 YA-3 16S rDNA序列系统发育树Fig.4 The 16S rDNA sequence phylogenetic tree of YA-3

3 讨 论

随着人们对环境和食品安全要求的提高,开发对人类和环境友好、并具良好防治效果的、新的生物农药已经成为当前的研究热点。由于枯草芽孢杆菌是自然界广泛存在的非致病菌,对人畜无害,不污染环境,并且能产生多种抗菌素和酶,具有极强的抗逆能力和对多种植物病害具较好防效,吸引大量学者开展研究,国外和国内已经开发出多种生防芽孢杆菌制剂,并广泛应用于生产。目前，国内用以防治番茄早疫病菌生防菌剂均还处于实试室研究阶段或小试阶段,因此开发新的生防资源具有一定的意义。

本试验室从西洋参种植土壤中分离得到一株拮抗细菌YA-3,经形态、生理生化特性及16S rDNA同源性分析结果,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),牛津杯试验表明，该菌株不但对番茄早疫病有显著的拮抗作用,同时对多种植物病原真菌均有明显的抑制作用。该拮抗菌的发现,为生物防治植物病害提供了新的、有效的生防资源,具有良好的应用前景。

本文主要研究了YA-3对番茄早疫病的生防作用,结果显示该拮抗细菌的代谢产物能够导致番茄早疫病病原菌菌丝溢缩、破裂,孢子畸形。这说明YA-3能代谢产生一种拮抗物质,抑制菌丝生长、孢子萌发,该拮抗物质有待进一步研究。通过YA-3在番茄叶片上定殖动态研究表明,该拮抗菌在番茄叶片有良好的定殖能力,其中先喷洒发酵液组拮抗菌的定殖数目最多、定殖时间最长,且室外盆栽试验显示保护作用组即先喷发酵液再接病原菌,对番茄早疫病的防治效果最好。这与Benizri[10]，Bloemberg[11]有关于生防菌株在田间的定殖能力是生物防治效果关键的报道相一致。此外，盆栽试验也表明拮抗菌YA-3发酵液对已发病植株也有良好的防治效果。这些为该拮抗菌应用于农业生产奠定了基础。

本研究表明YA-3是一株在番茄叶片有良好定殖能力并对番茄早疫病有良好防治效果的拮抗菌,具有较高的生防价值和田间应用前景,值得进一步研究。然而，在自然条件下生防菌的防治效果受多种因素的影响,因此，菌株YA-3对植物病菌在大田条件下的防治效果还有待于进一步研究。

[1] GRIGOLLI J F J, KUBOTA M M, ALVES D P, el al. Characterization of tomato accessions for resistance to early blight[J]. Crop Breed and Applied Biotechnolgy, 2011, 11(2): 174-180.

[2] 徐志刚. 普通植物病理学[M]. 北京: 中国农业出版社, 1997.

[3] MA Z H, FELTS D, MICHAILIDES T J. Resistance to azoxystrobin in Alternaria isolates from pistachio in California[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2003, 77(2): 66-74.

[4] CALIGARI P D S, NACHMIAS A. Screening for field resistance to early blight (Alternaria solani) in potatoes[J]. Potato Research, 1988, 31(3): 451-460.

[5] KHAN N, MISHRA A, NAUTIYAL C S. Paenibacillus lentimorbus B-30488rcontrols early blight disease in tomato by inducing host resistance associated gene expression and inhibiting Alternaria solani[J]. Biological Control, 2012, 62(2): 65-74.

[6] 周防震, 彭振坤. 番茄早疫病拮抗菌酵母的筛选[J]. 湖北民族学院学报(自然科学版), 2003, 21(4): 14-17.

[7] 沈萍.微生物学实验[M]. 3版.北京:高等教育出版社; 1999.

[8] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001.

[9] BUCHANAN R E, GIBBONS N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 8版. 北京: 科学出版社, 1984.

[10] BENIZRI E, BAUDOIN E, GUCKERT A. Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria [J]. Biocontrol Science Technology, 2001, 11(5): 557-574.

[11] BLOEMBERG G V, LUGTENBERG B J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2001, 4(4): 343-350.

(编 辑陈镱文)

Control efficacy ofBacillussubtilisYA-3 on tomato early blight

ZHANG Xiao-qin, ZHANG Xiao, HE Xiao-rui, NIU Ming-yang, HUANG Jian-xin

(College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069, China)

Biocontrol bacterial YA-3 was isolated from the soil of American ginseng planting in Shaanxi Liuba.The results of the antagonistic tests by cylinder plate methods showed that there were 13 kinds of plant pathogens inhibited in different degrees by fermentaion broth of the antagonistic bacteria, the inhibited rate of tomato early blight reached 82.2%.The culture filtrate of YA-3 can lead to the pathogen hyphae of tomato early blight distortion,wither or fracture and inhibit the growth of mycelia.Additionally, the inhibition rate of the spore germination was more than 92.3%.Determining of the colonization by the signed rifampicin-resistance in YA-3 showed that it could colonize well in tomato leaves, the group which sprayed the fermentation broth of YA-3 firstly was found to have the longest colonization time and the existence of antagonistic bacteria can still be detected within 26 days.The pot experiment revealed that the control effect reached 62.43%.It was identified asBacillussubtilison the basis of morphological, physiological and biochemical characters as well as the sequence analysis of 16S rDNA.

tomato early blight;Bacillussubtilis; antagonism; biocontrol

2014-10-25

陕西省自然科学基金资助项目(SJ08ZT08-2)

张晓琴，女，甘肃兰州人，从事微生物资源利用研究。

黄建新，女，陕西西安人，西北大学教授，从事微生物资源应用研究。

Q939.95

：ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2015-03-015