庞学丰 舒建龙 李玉玲 吴燕红 唐丽萍 刘 欢 蒙宇华 冯玉青 雷宗尚龙朝阳 廖键侥 林 菊 广西中医药大学附属瑞康医院（南宁 530011）

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以侵犯外周关节为主的自身免疫病，晚期患者出现关节结构破坏、畸形以及功能丧失。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种在RA发病中起到重要作用的血管新生诱导剂。本实验采用牛Ⅱ型胶原蛋白和弗氏不完全佐剂混合诱导CIA大鼠模型，观察寒痹康汤对其血清VEGF水平的影响情况。

1 实验用品及材料 60只清洁级Wistar雌性大鼠（体重100±10g）购于广西中医药大学实验动物中心；实验用VEGF检测试剂盒、弗氏不完全佐剂和牛Ⅱ型胶原蛋白分别购于南京建成生物工程研究所、美国Chondrex公司；对照药甲氨蝶呤片为上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂产品；补肾抗风湿方药（寒痹康汤）提取物由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备提供，将寒痹康汤（秦艽、黄芪、青风藤各15g，防风、熟附子、麻黄、当归各10g，淫羊藿、狗脊各20g）经乙醇萃取，50℃溶解离心，取上清液得到含有活性部位的浸膏，实验前用溶剂（2%乙醇＋98%生理盐水）配制成2×10－7g／L的溶液。

2 实验方法 2.1 分组与造模 60只清洁级Wistar雌性大鼠喂养7d后，随机挑选10只作为正常对照组，剩下50只参照文献［1］方法进行造模：在无菌条件下用冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型胶原蛋白，再与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合乳化制成CⅡ乳剂，放置4℃冰箱保存。实验时于大鼠颈、背部进行多点皮内注射CⅡ乳剂造模，14d后再次注射CⅡ乳剂进行免疫（方法和剂量同前）。造模成功的标准是大鼠四肢足爪均严重肿胀、踝关节直径增长幅度≥2mm（评分4分）。确定造模成功后，再随机分为模型组、寒痹康汤高、中、低剂量组、甲氨蝶呤组，每组10只。

2.2 给 药 正常对照组大鼠自由进食和饮水；模型组灌服生理盐水（2mL／100g），1d1次；甲氨蝶呤组每周灌服甲氨蝶呤药液（2.7mg·kg－1）1d1次；寒痹康汤高、中、低剂量组，分别给予31.25g／100g／d、15g／100g／d、7.5g／100g／d寒痹康汤提取物（1d分2次）进行灌胃。

2.3 关节肿胀评分 参照有关文献［2］标准进行评分：无关节炎评0分，小趾关节轻度肿胀评1分，小趾关节和足跖肿胀评2分，踝关节以下的足爪肿胀评3分，包括踝关节在内全部关节肿胀评4分。观察并记录各组大鼠治疗前、治疗后1周、2周、4周的关节肿胀情况。

2.4 血清VEGF水平的检测 给药治疗28d后，用水合氯醛麻醉各组大鼠，于腹主动脉处取血，分离血清后保存于－20℃冰箱，检测时按试剂盒说明采用ELISA法测定VEGF的含量。

2.5 统计学分析 采用SPSS15.0统计软件进行数据分析，所有数据以（）表示，不同组间用方差分析及t检验。

3 实验结果 3.1 治疗前后各组大鼠关节肿胀情况比较 治疗2周后，各治疗组大鼠关节肿胀指数均低于模型组，其中寒痹康汤高、中剂量组、甲氨蝶呤组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。治疗4周后，各治疗组大鼠关节肿胀指数与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），其中高剂量寒痹康汤作用优于甲氨蝶呤（P＜0.01），中剂量寒痹康汤作用与甲氨蝶呤相当（P＞0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠关节肿胀指数比较（）

表1 各组大鼠关节肿胀指数比较（）

注：与模型组比较，△P＜0.01，▲P＜0.05；与甲氨蝶呤组比较，◇P＜0.01，◆P＞0.05

组 别 n 给药前 治疗后1周 治疗后2周 治疗后4周正常组10 0 0 0 0模型组 10 3.86±0.24 3.86±0.17 3.78±0.18 3.62±0.13寒痹康汤高剂量组 10 3.91±0.16 3.74±0.25 2.72±0.47△ 1.64±0.32◇寒痹康汤中剂量组 10 3.88±0.18 3.79±0.19 3.13±0.36△ 2.18±0.52◆寒痹康汤低剂量组 10 3.92±0.16 3.84±0.17 3.59±0.13▲ 2.88±0.31甲氨蝶呤组 10 3.89±0.22 3.83±0.23 3.16±0.46△1.85±0.27

3.2 治疗前后各组大鼠血清VEGF变化比较 各组VEGF水平与正常对照组比较均升高（P＜0.01）；治疗4周后各给药组血清VEGF水平与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），其中高剂量寒痹康汤作用优于甲氨蝶呤（P＜0.01）、中剂量寒痹康汤作用与甲氨蝶呤相当（P＞0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清VEGF变化情况比较（）

表2 各组大鼠血清VEGF变化情况比较（）

注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.01；与甲氨蝶呤组比较，◇P＜0.01，◆P＞0.05

组别 n VEGF浓度（pg／mL）正常组10 32.49±3.46模型组 10 70.75±5.19△寒痹康汤高剂量组 10 42.65±3.37△▲◇寒痹康汤中剂量组 10 46.84±2.71△▲◆寒痹康汤低剂量组 10 63.84±6.32△▲甲氨蝶呤组 10 54.25±3.75△▲

4 讨 论 类风湿关节炎的病理改变是炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成、侵蚀软骨及骨组织，血管翳是造成关节破坏、畸形、功能障碍的病理基础，血管新生是RA慢性增生性滑膜炎和血管翳形成中的一个重要环节，血管内皮生长因子是血管生成中最重要的因子之一，在RA的发病中其可以通过受体特异性作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞的有丝分裂和新生血管的形成；VEGF又能增强血管的通透性，促使血管内物质的渗出，血管内营养物质的渗出为滑膜增生提供营养；血管内炎性细胞和炎性介质的渗出促进了滑膜炎症的持续存在［1］。有研究表明RA患者血清中VEGF水平较骨关节炎及健康对照组明显升高，并且其升高水平与病情严重程度及类风湿因子、炎性指标相关，可以做为判断疾病活动的指标［3－4］。有实验证实向关节腔内注射VEGF抗体或其受体拮抗剂可有效抑制滑膜血管翳的形成，减轻RA的发病症状［5］，因此抑制VEGF的表达已经成为治疗RA的一个靶点和研究方向。

RA属中医“痹病”范畴，《素问·痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”《素问·评热病论》曰：“邪之所凑，其气必虚。”痹病的发生与正气亏虚及感受风寒湿之邪有关，其治疗当以扶正祛邪为原则。寒痹康汤是庞学丰教授治疗寒湿型活动期RA的经验方，由补肾及抗风湿药物组成，具有补益肝肾、益气血、祛风除湿、蠲痹止痛的作用。我们在临床上应用寒痹康汤治疗寒湿型RA患者，发现其能改善患者关节疼痛［6］、肿胀、压痛、晨僵等症状，能使升高的血沉、CRP、RF、免疫球蛋白等下降或恢复正常，无明显毒副作用。动物实验表明寒痹康汤能降低 CIA大鼠 TNF－α、IL-6、IL-1β、NFκ-B的水平［7－9］，而这些细胞因子在RA的发病、发展过程当中，可以诱导VEGF的高表达，从而起到非常重要的作用。

本实验结果发现经寒痹康汤治疗后CIA大鼠血清VEGF水平和关节肿胀指数均相应降低，关节炎症状逐渐减轻，表明寒痹康汤能减轻CIA大鼠关节肿胀指数，降低VEGF水平，其能通过抑制VEGF的产生，抑制血管新生以及血管翳的生成，从而抑制关节滑膜增殖，减轻关节滑膜的炎症，延缓关节骨质破坏，是其治疗RA的作用机理之一。

［1］邓安梅，仲人前，陈孙孝，等.关节炎中B7：CD28／CTLA-4共刺激途径的实验研究［J.中国免疫学杂志，200516（8）：412-414.

［2］Shibuya M.Differential roles of vascular endothelial growth factor receptor-1and receptor-2in angiogenesis［J］.J Biochem MolBiol，2006，39（5）：469-478.

［3］Clavel G，Bessis N，Lemeiter D，et al Angiogenes is markers（VEGF，soluble receptor of VEGF and ang iopoietin-1）in very early arthritis and their association with inflammation and joint destruction［J］.Clinical Immunology，2007，124（2）：158-164.

［4］樊有龙，傅颖媛.类风湿关节炎患者AECA、VEGF、IL-17的检测及临床相关性研究［J］.中国实验诊断学，2010，14（6）：907-910.

［5］Grosios K，Wood J，Esser R，et al.Angiogenesis inhibition by the novel VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor，PTK787ZK222584causes significant anti-arthritic effects in models of rheumatoid arthritis［J］.Inflamm Res，2014，53（4）：133.

［6］庞学丰，吴燕红，蒙宇华.补益肝肾、祛湿蠲痹法治疗寒湿型类风湿关节炎的临床研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2006，14（1）：40-42.

［7］庞学丰，张 红，唐丽萍，等.寒痹康汤对实验性关节炎大鼠血清 TNF-α的影响［J］.中医正骨，2008，20（12）：1-2.

［8］庞学丰，高立珍，吴燕红，等.寒痹康汤对实验性关节炎大鼠血清IL-6NO 的影响［J］.辽宁中医杂志，2009，36（3）：481-482.

［9］庞学丰，任志宏，程世和，等.寒痹康汤对实验性关节炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影响［J］.陕西中医，2009，30（7）：919-920.