马致南, 徐　扬, 邬姝阳, 曾　新, 李　萍

(1. 江苏省扬州市妇幼保健院 妇产科, 江苏 扬州, 225000;

江苏省2. 南京市玄武区妇幼保健所 妇科 江苏 南京, 210029;

3. 江苏省南京市妇幼保健院 妇幼医学研究中心, 江苏 南京, 210004;

4. 江苏省南京市妇幼保健院 妇科 内分泌科, 江苏 南京, 210004)

miR-1976在细菌性阴道病中的作用及其机制

马致南1, 徐扬1, 邬姝阳2, 曾新3, 李萍4

(1. 江苏省扬州市妇幼保健院 妇产科, 江苏 扬州, 225000;

江苏省2. 南京市玄武区妇幼保健所 妇科 江苏 南京, 210029;

3. 江苏省南京市妇幼保健院 妇幼医学研究中心, 江苏 南京, 210004;

4. 江苏省南京市妇幼保健院 妇科 内分泌科, 江苏 南京, 210004)

摘要:目的阐述miR-1976及CD105, 整合素αvβ6的关系,探讨三者在阴道感染中的作用及机制。方法采用Real-Time PCR方法检测健康及细菌性阴道病患者阴道黏膜组织中miR-1976与CD105、整合素αvβ6的表达；评估阴道上皮细胞系VK2/E6E7过表达miR-1976后其CD105, 整合素αvβ6的表达情况；阐述过表达miR-1976对VK2/E6E7细胞增殖和凋亡的影响。结果细菌性阴道病患者阴道黏膜组织中miR-1976显著低表达，而CD105, 整合素αvβ6的mRNA显著高表达(P<0.05); VK2/E6E7细胞过表达miR-1976后，其增殖和凋亡未受明显影响，而CD105和整合素 αvβ6的mRNA则显著低表达(P<0.05)。结论miR-1976通过CD105调节整合素αvβ6的表达，从而影响阴道上皮细胞的黏附能力，参与细菌性阴道病的发生。

关键词:细菌性阴道病; miR-1976; CD105; 整合素αvβ6

病原微生物定植于阴道黏膜表面是阴道炎发生的第一步。当发生病原微生物入侵时，阴道黏膜上皮细胞迅速脱落(剥离)，以保护机体免受感染；但大多数病原微生物可通过改变阴道黏膜上皮细胞的黏着能力，阻断细胞的迁移与脱落，从而定植于阴道黏膜，破坏其防御，导致阴道炎。治疗阴道炎，从阴道黏膜本身的防御功能及机制出发，寻找新的治疗靶标，有可能改变目前阴道炎治疗效果不佳的现状[1-3]。

整合素是细胞表面黏附分子家族成员之一，介导细胞间及细胞与细胞外基质(ECM)的黏附反应及信号传递，调节细胞的各种生物学行为，对细胞黏附、生存、生长、增殖、凋亡起主要调节作用[4]。其中，整合素的亚型αvβ6在肠道黏膜的感染与防御中具有重要的调控作用[5-6], 考虑到不同部位的黏膜具有相似特性，因此整合素家族成员αvβ6也可能是参与了阴道黏膜感染与防御的关键分子。

本研究检测了细菌性阴道病女性阴道黏膜组织中miR-1976与CD105、整合素αvβ6的表达情况，并检测了miR-1976在阴道上皮细胞VK2/E6E7中过表达后对其增殖和凋亡的影响以及对CD105与整合素αvβ6表达的影响，以期阐述miR-1976与CD105、整合素 αvβ6在阴道感染中的关系、作用及机制。

1资料与方法

1.1　标本收集和处理

收集2013年9月—2014年5月由于子宫良性肿瘤在本院行全子宫切除术的健康与细菌性阴道病女性的阴道黏膜组织各30 例，术中黏膜组织离体后以4 ℃无菌PBS缓冲液冲洗后迅速置入液氮，保存待用。

1.2　材料来源

人阴道上皮细胞系VK2/E6E7购于美国模式培养物集存库(ATCC); K-SFM培养基(美国Gibco); miR-1976慢病毒过表达载体(上海吉凯); Trizol(美国Invitrogen); Real-Time PCR试剂盒(美国Thermo); PR-7-AAD凋亡试剂盒(美国BD)；未提及试剂均购自美国Gibco公司。

1.3　方法

1.3.1Real-Time PCR:检测健康女性与细菌性阴道病女性阴道黏膜中miR-1976, CD105、整合素 αvβ6的mRNA表达。按Trizol说明书提取组织总RNA，经紫外分光光度法定量后，应用实时荧光定量(RT-PCR)法检测细胞中CD105、整合素β6亚基、内参GAPDH基因mRNA表达水平。β6亚基上游引物序列: 5′-GAAGGAATGATCACGTACAAGGT-3′, 下游引物序列: 5′-AGCAGGCAGTCTTCACAGGT-3′; GAPDH基因上游引物序列: 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′, 下游引物序列: 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。实时荧光定量RT-PCR采用Taqman探针法，反应体系20 μL: 荧光定量探针反应预混液10 μL, 探针和引物预混液1 μL, 模板cDNA 1 μL, 水8 μL。cDNA模板扩增反应条件: 95 ℃ 10 min变性; 95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40个循环。RT-PCR每次实验设3个复孔，实验重复3次。

1.3.2细胞培养: VK2/E6E7细胞复苏后培养于K-SFM培养基，置于37 ℃、含5%CO2的培养箱中，当细胞贴壁后达到90%融合时，以0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA消化液消化8 min, 倒置显微镜下观察见细胞形态变圆漂浮后，加入含10% FBS的DMEM/F-12培养基，吸取细胞悬液至10 mL离心管, 1 000 r/min离心10 min, 弃上清, 1∶3转移细胞至25 cm培养瓶继续培养，每2～3 d传代1次。

1.3.3慢病毒转染: 克隆人miR-1976所在区域500 bp左右的基因组序列(minigene), 构建慢病毒过表达载体(GFP作为 marker); 以只含GFP的慢病毒载体为对照，包被成慢病毒颗粒，感染VK2/E6E7细胞; 72 h后在荧光显微镜下观察GFP荧光蛋白表达，判断病毒感染效率。经预实验后确定感染复数(MOI)=10, 将3×105个细胞接种至25 cm小瓶中(融合度约30%), 贴壁后加入miR-1976过表达慢病毒约12 μL(浓度为1×109TU/mL), 同时加入polybrene 3 μL(20 mg/mL)以增强转染效率；在37 ℃含5% CO2培养箱中培养12 h后更换新鲜培养基。转染72 h后荧光显微镜下观察GFP荧光蛋白表达以判定转染效果；采用Real-Time PCR技术验证细胞内成熟miR-1976是否过表达。同法转染只含GFP的空白载体病毒。

1.4　MTT 法检测细胞增殖

转染miR-1976过表达慢病毒载体72 h后，将VK2/E6E7细胞以4 000个/孔置入96孔板中，同时设置阴性对照和空白对照组，每组设6个平行孔，继续培养0、24、48、72 h，于每孔加入浓度为5 μg/mL的MTT溶液10 μL, 继续培养4 h, 弃上清，每孔加100 μL DMSO溶液终止反应，摇床震荡10 min, 在酶标仪上测出每孔490 nm波长的吸光度值，绘制细胞增殖曲线。实验重复3次。

1.5　PE-7AAD双标记法检测细胞凋亡

细胞转染miR-1976过表达慢病毒载体培养72 h后收获细胞, PBS洗涤2次，重悬于100 μL 1×Binding Buffer, 混匀，加入5 μL PE和5 μL 7-AAD, 室温避光反应15 min; 300 g、4℃离心5 min, 弃上清，加400 μL 1×Binding Buffer, 混匀。1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。设置空白对照组及阴性对照组。实验重复3次。

Real-Time PCR法检测CD105与整合素αvβ6在过表达miR-1976的VK2/E6E7细胞与其对照组细胞中的表达情况。方法同前。

2结果

2.1　miR-1976、CD105及整合素αvβ6在细菌性阴道病女性阴道黏膜组织中的表达

表达三PCR: glycumtance ogy, Nan Nanjing, Nanjing, Jiangsu, Real-Time PCR检测健康与细菌性阴道病女性的阴道黏膜组织各30例，细菌性阴道病女性阴道黏膜组织中miR-1976表达下调6.3倍，差异有统计学意义(P<0.05), 表明细菌性阴道病女性阴道黏膜中miR-1976明显下调(图1A)。Real-Time PCR检测健康与细菌性阴道病女性的阴道黏膜组织，可见CD105在细菌性阴道病女性阴道黏膜组织中表达增高3.1倍，整合素αvβ6在细菌性阴道病女性阴道黏膜组织中表达增高2.4倍，差异有统计学意义(P<0.05), 表明CD105、整合素αvβ6在细菌性阴道病女性的阴道黏膜组织中显著高表达(图1 B、1C)。

A. miR-1976在细菌性阴道病组低表达

B. CD105在细菌性阴道病组高表达

C. 整合素αvβ6在细菌性阴道病组高表达

图1miR-1976与CD105、整合素αvβ6在

细菌性阴道病女性阴道黏膜组织中的表达

2.2　过表达miR-1976对VK2/E6E7细胞中miR-1976与CD105、整合素αvβ6表达的影响

荧光显微镜结果如图2B示，绿色荧光为GFP表达，可见转染阳性率>80%，慢病毒转染成功。

2.3　Real-Time PCR及MTT结果

VK2/E6E7细胞中miR-1976表达增高(约5.5倍)(图3 A); MTT结果示慢病毒转染后，过表达miR-1976细胞与空载慢病毒细胞均于细胞培养约36 h达增殖平台期，慢病毒载体对细胞增殖能力无明显影响(图3B)。

2.4　细胞凋亡

慢病毒转染VK2/E6E7细胞后，细胞凋亡率明显增加，未转染细胞凋亡率为1%，而转染空载慢病毒载体的细胞凋亡率为60.2%; 但转染过表达miR-1976慢病毒载体的细胞凋亡率较空载慢病毒凋亡率低，仅为32.5%, 差异有统计学意义(P<0.05), 表明miR-1976过表达后慢病毒载体对VK2/E6E7细胞凋亡有明显影响，而miR-1976过表达则对其凋亡无明显影响(图4)。

A. 摄于白光

B. 摄于绿光

A. miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7

B. miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7

细胞后对其增殖的影响情况

图3miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7细胞

2.5　miR-1976过表达的VK2/E6E7细胞中CD105及整合素αvβ6的表达

miR-1976过表达的VK2/E6E7细胞中CD105表达下调2.3倍，整合素αvβ6表达下调2.1倍，差异有统计学意义(P<0.05), 表明VK2/E6E7细胞中过表达miR-1976后CD105及整合素αvβ6表达明显下调(图5)。

A. 为对照组细胞的凋亡情况; B. 为空载慢病毒载体对细胞凋亡的影响; C. 为miR-1976过表达对细胞凋亡的影响。

图4过表达miR-1976对VK2/E6E7细胞凋亡的影响

3讨论

越来越多的研究[7]显示，具有调控功能的非编码RNA-miRNAs是有潜力的生物标志物，其大小20～25个核苷酸。成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物(RISC)引导下在转录后对靶基因mRNA的表达实施调控。在哺乳动物中，多数情况是与部分互补mRNA的3′-UTR区片段完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其转录后蛋白质的翻译，即负向调控基因表达。microRNA

图5 miR1976过表达对CD105与整合素αvβ6表达的影响

在人类多种疾病中发挥调控作用，可以作为潜在的诊断标志、预后标志及治疗靶标[8]。本实验发现miR-1976在细菌性阴道病患者阴道黏膜组织中的表达明显下调，同时CD105及整合素αvβ6的表达明显上升; miR-1976过表达慢病毒载体不影响VK2/E6E7细胞的增殖和凋亡，但其过表达后阴道上皮细胞VK2/E6E7中CD105及整合素αvβ6表达明显下调。这一结果提示miR-1976可能通过调节 CD105的表达进而调节整合素αvβ6的表达，从而影响阴道上皮细胞的黏着能力，进而参与阴道黏膜的感染与防御功能。

CD105是一类比较新的细胞黏附分子，主要与细胞的增殖有关并参与肿瘤血管的生成；细胞表面的αvβ6通过胞外区与其配体结合后，通过胞内区与细胞内骨架蛋白如肌动蛋白、踝蛋白和纽蛋白等相互作用，介导细胞黏附，并将细胞外基质(ECM)所承载的信号经过复杂的通路传递至细胞核内，从而影响细胞基因的表达，进而影响细胞的运动、增殖、分化、凋亡[9]。本研究结果证实，细菌性阴道病女性阴道黏膜组织中整合素αvβ6的表达显著高于正常女性阴道黏膜组织，提示整合素αvβ6在细菌性阴道病中发挥重要作用。miR-1976在VK2/E6E7细胞过表达后使CD105表达下调、同时使整合素αvβ6的表达下调，提示miR-1976可能在阴道上皮细胞中直接调控CD105、整合素αvβ6。

Muenzner等[10]在Science发表的研究论文证实，阴道中的淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)与黏膜上皮细胞表面的癌胚抗原相关的细胞黏附分子(CEACAMs)结合将引发 CD105的从头合成, CD105通过激活整合素的内向信号转导功能使整合素的活性增加，增强受感染的黏膜上皮细胞的黏着能力，避免其迁移与脱落，有利于淋病奈瑟菌的定植及感染。这与本研究结果具有一致性。分析细菌性阴道病发病机制可能为miR-1976低表达，解除了对靶基因CD105的抑制作用, CD105从头合成增加，增强整合素αvβ6的活性，使阴道壁上皮细胞的黏附能力增强，脱落减少，有利于致病菌定植于阴道壁上皮细胞并感染细胞，从而导致细菌性阴道病的发生。

本研究通过比较miR-1976过表达前后VK2/E6E7细胞中CD105和整合素αvβ6表达水平的变化，发现miR-1976过表达可以下调CD105和整合素αvβ6的表达，这将有助于阐明 miR-1976 在阴道上皮细胞中的生物学功能及其参与阴道黏膜感染与防御功能的分子机制，提示miR-1976可能成为一个新的极具前景的阴道炎治疗的靶点。

参考文献

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[2]Li Z, Palaniyandi S, Zeng R, et al. Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection[J]. Proc Natl Acad Sci, 2011, 108(11):4388.

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[8]Thum, T. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts[J]. Nature, 2008, 456: 980.

[9]牛卫博, 牛军, 徐克森, 等. αvβ6整合素与肿瘤关系的研究进展[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2008, 15(21): 1674.

[10]Muenzner P, Bachmann V, Zimmermann W, et al. Human-restricted bacterial pathogens block shedding of epithelial cells by stimulating integrin activation[J]. Science, 2010, 329(5996): 1197.

Function and mechanism of miR-1976 in bacterial vaginosis

MA Zhinan1, XU Yang1, WU Shuyang2,

ZENG Xin3, LI Ping4

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,YangzhouMaternalandChildHealthCare

Hospital,Yangzhou,Jiangsu, 225000; 2.DepartmentofGynecology,Maternaland

ChildHealthCareCenterofXuanwuDistrictinNanjing,Nanjing,Jiangsu, 210029;

3.TheResearchCenterofMaternalandChildMedicine,NanjingMaternal

andChildHealthCareHospital,Nanjing,Jiangsu, 210004; 4.Departmentof

Gynecology,NanjingMaternalandChildHealthCareHospital,Nanjing,Jiangsu, 210004)

ABSTRACT:ObjectiveTo clarify the relationship among miR-1976, CD105and integrin αvβ6 and to evaluate the function and mechanism of miR-1976, CD105and integrin αvβ6 in vaginal mucosa infection.MethodsThe expression levels of miR-1976, CD105and integrin αvβ6 in vaginal mucosa of healthy women and vaginitis ones were detected by real-time PCR, and the expression levels of CD105and integrin αvβ6 in VK2/E6E7 cell lines were investigated under the circumstance of miR-1976 over-expressed. Meanwhile, flow cytometry was used to evaluate the influence of lentivirus on cell proliferation and apoptosis.ResultsThe expression of miR-1976 was significantly lower in vaginitis mucosa than in healthy ones(P<0.05), and the mRNA of CD105and integrin αvβ6 were much higher reversely(P<0.05). After miR-1976 was over-expressed in VK2/E6E7 cell lines, the cell proliferation and apoptosis were scarcely impacted by the lentivirus, and the mRNA of CD105and integrin αvβ6 were much lower than before(P<0.05). ConclusionIt has been verified that miR-1976 can regulate the expression of integrin αvβ6 through CD105, and miR-1976 also participate in vaginal mucosa infection through influencing the adhesion ability of vaginal mucosa cells.

KEYWORDS:bacterial vaginal disease; miR-1976；CD105; integrin αvβ6

通信作者:李萍, E-mail:liping0099@126.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81370679); 江苏省扬州市科技计划项目(2014189)

收稿日期:2014-12-20

中图分类号:R 711.73

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)07-006-05DOI: 10.7619/jcmp.201507002