张 囡，钱宇坤，李维超

(天津市儿童医院，天津 300074)



病毒合剂(Ⅱ)中黄芩苷、绿原酸和橙皮苷的含量测定

张 囡，钱宇坤，李维超

(天津市儿童医院，天津 300074)

目的：建立HPLC法同时测定病毒合剂中黄芩苷、绿原酸和橙皮苷的含量。方法：色谱柱为Acclaim120 C18120A(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A为0.4%磷酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长300 nm，进样量10 μl。结果：黄芩苷、绿原酸和橙皮苷分别在29.16～121.50 μg/ml(r=0.999 9)、3.23～13.44 μg/ml(r=0.999 7)和6.55～27.30 μg/ml(r=0.999 9)范围内与峰面积呈良好线性关系。平均回收率黄芩苷为102.6%(RSD为0.87%，n=6)，绿原酸为100.1%(RSD为0.96%，n=6)，橙皮苷为98.38%(RSD为0.38%，n=6)。结论：本方法简便、快速、结果准确、重现性好、灵敏度高，可用于病毒合剂的质量控制。

病毒合剂，黄芩苷，绿原酸，橙皮苷，HPLC

病毒合剂(Ⅱ)为本院院内制剂，由玄参、淡豆豉、黄芩、金银花、陈皮等14味中药制成，具有止咳定喘、清热解表的功效，在治疗小儿感冒发烧、有汗或无汗、鼻流清涕及病毒性肺炎方面疗效显著。黄芩苷为黄芩的主要有效成分之一，现代药理学研究表明, 黄芩苷具有多种药理作用, 但以解热镇痛、抗感染、抗菌抗病毒、降压等作用尤为突出[1]，其抗病毒作用机制可能是抑制ATP合成酶[2]。绿原酸为金银花的主要有效成分,有多种生物活性，如：心血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗辐射作用、抗菌抗病毒作用等[3]。橙皮苷为陈皮的主要成分，其具有保护毛细血管、防止微血管破裂出血的作用，陈皮是治疗高血压和心肌梗塞的药物[4]，同时也是健脾通气、助消化的良药。《天津市医疗制剂规范2008年版》中收录病毒合剂(Ⅱ)的质量标准含量测定要求中仅有黄芩苷的含量测定，现为提高其标准、有效控制产品质量，本文参照文献[5-7]，采用HPLC法通过优化色谱条件，建立不需经过提取分离，直接利用梯度洗脱的方式同时测定病毒合剂中黄芩苷、绿原酸和橙皮苷含量的方法，并以此作为该制剂的质量控制指标。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津)；LC solution 色谱工作站；AL-104电子天平(瑞士-梅特勒托利多公司)；EQ-AS1000GVDE型双频恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52A 旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 试药 黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110715-201318)，绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110753-201314)，橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110721-200613)，病毒合剂(Ⅱ)(本院制剂室，批号20140202、20140301、20140302，规格100 ml/瓶)，甲醇、乙腈和磷酸均为色谱纯，去离子水(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Acclaim120 C18120A (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以0.4%磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱条件见表1。检测波长：300 nm；流速：1 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μl[8-10]。

表1 梯度法脱条件

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、绿原酸各适量，分别加50%甲醇制成浓度为121.5 μg/ml的黄芩苷及浓度为13.44 μg/ml的绿原酸对照品溶液；精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成浓度为27.3 μg/ml的橙皮苷对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取病毒合剂(Ⅱ)2 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方配比，制备不含黄芩、金银花和陈皮的阴性样品，依“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件测定，色谱图见图1。理论板数按黄芩苷、绿原酸和橙皮苷峰计算均应不低于2 500。

1.绿原酸 2.橙皮苷 3.黄芩苷

2.4 线性关系考查 分别精密量取黄芩苷对照品溶液(48.6 μg/ml)、绿原酸对照品溶液(5.38 μg/ml)、橙皮苷对照品溶液(10.92 μg/ml)6.00、8.00、10.00、12.00、15.00和25.00 ml置25 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积A为纵坐标，进样浓度C(μg/ml)为横坐标绘制标准曲线。黄芩苷、绿原酸和橙皮苷的回归方程分别为：A=16 644.99C+13 953.09(r=0.999 9，n=6)、A=22 728.88C-580.84(r=0.999 7，n=6)和A=9 208.49C-959.4(r=0.999 9，n=6)。结果表明黄芩苷在29.16～121.50 μg/ml范围内与峰面积呈现良好线性关系；绿原酸在3.23～13.44 μg/ml范围内与峰面积呈现良好线性关系；橙皮苷在6.55～27.30 μg/ml范围内与峰面积呈现良好线性关系。

2.6 精密度试验 取浓度0.060 8 mg/ml黄芩苷、0.006 72 mg/ml绿原酸和0.006 83 mg/ml橙皮苷的混合对照品溶液，重复进样6次，其中黄芩苷RSD为0.97%，绿原酸RSD为1.1%，橙皮苷RSD为0.47%，表明本试验所用的方法精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同一批号样品(20140301)1份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、6、8、12和24 h后，按“2.1”项下色谱条件测定，测得24 h内峰面积，结果显示黄芩苷RSD为0.43%，绿原酸RSD为0.85%，橙皮苷RSD为0.72%，表明样品溶液24 h内稳定性良好。

2.8 重现性试验 取同一批号样品(20140202)6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进样，结果样品中黄芩苷、绿原酸、橙皮苷RSD分别为0.64%、1.45%和0.95%。

2.9 加样回收率试验 分别取黄芩苷对照品的50%甲醇溶液(0.588 0 mg/ml)、绿原酸的50%甲醇溶液(0.062 4 mg/ml)、橙皮苷的甲醇溶液(0.180 0 mg/ml)，各精密量取5 ml，每种对照品6份，分别置50 ml圆底烧瓶中，减压蒸干，分别精密加入同一批号(20140202)供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，计算回收率。结果显示黄芩苷平均回收率为102.6%，RSD为0.87%；绿原酸平均回收率为100.1%，RSD为0.96%；橙皮苷平均回收率为98.38%，RSD为0.38%。结果见下表2-表4。

表2 黄芩苷回收率试验结果

表3 绿原酸回收率试验结果

表4 橙皮苷回收率试验结果

2.10 样品测定 取病毒合剂(Ⅱ)样品3批(批号20140202、20140301、20140302)，每批各两份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，用外标法计算样品中黄芩苷、绿原酸和橙皮苷的含量。结果见表5。根据测定结果暂定本品每1 ml含黄芩以黄芩苷计，不得少于3.0 mg；含金银花以绿原酸计不得少于0.3 mg；含陈皮以橙皮苷计，不得少于0.5 mg。

表5 3批病毒合剂样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 黄芩苷、绿原酸和橙皮苷在《中国药典》测定方法中检测波长分别为[7]280、328和283 nm，综合考虑这3种成分的波长及色谱峰的峰形、分离度等，最终选定300 nm作为本试验的检测波长。

3.2 本试验考虑到成品制剂工艺中无醇沉步骤，不宜使用稀醇溶液进行稀释，故确定用水直接稀释定容后测定几种成分含量，该方法经济、环保，而且满足定量分析准确度的要求。

1 刘学杰，姜慧祯，林娜.双贝糖浆中黄芩苷的含量测定[J].西北药学杂志，2011,26(1)：8-10

2 Chinnam H N，Dadi P，Sabri S，etal．Dietary bioflavonoids inhibit Escherichia coli ATP synthase in a differential manner[J]．Int J Biol Macromol，2010，46(5)：478-486

3 刘颖，郭明晔，白根本.绿原酸的研究进展[J].中药材，2012，35(7):1180-1185

4 Fernandez Sebastion P，Wasowski Cristina,Paladini Alejandro C.Synergistic interaction between hesperidin,a natural flavonoid,and diazepam[J].European Journal of Pharmacology，2005，512(2-3):189-198

5 乔岩岩，彭家钢，杨瑞芬，等.高效液相色谱法测定清开灵颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].湖北中医药大学学报，2013，15(3)：38-41

6 王健，陈双璐，林宏，等.HPLC法同时测定小儿抗病毒颗粒中黄芩苷和橙皮苷的含量[J].天津药学，2013，25(5)：12-15

7 中国药典[S].二部.2010：159，205，282

8 刘红，刘辉，刘彬果. 高效液相色谱法测定急麻颗粒中黄芩苷的含量[J].天津药学，2014，26(6)：11-12

9 张囡，陈双璐，钱宇坤. HPLC法测定清肺丸中黄芩苷和柚皮苷含量[J].天津药学，2011,23(6)：6-8

10 王洪志，乔晓莉，刘勇，等. 高效液相色谱法测定复方承气颗粒中芍药苷和橙皮苷的含量[J].天津药学，2012,24(6)：9-11

2015-02-09

R927.2

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1006-5687(2015)03-0013-03