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基于PCR的几种分子检测技术在布鲁氏菌鉴定中的应用

2015-02-22波综述崔步云审校

重庆医学 2015年34期
关键词:布鲁氏菌基因组特异性

赵 波综述,崔步云审校

(1.重庆市疾病预防控制中心微生物所 400042;2.中国疾病预防控制中心传染病所,北京102206)

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体引起的人兽共患传染病,常造成牲畜流产和人类多器官的损害。布鲁氏菌属基于宿主特异性分为6个种19个型:马耳他布鲁氏菌(羊型布鲁氏菌)3个型、流产布鲁氏菌(牛型布鲁氏菌)8个型、猪布鲁氏菌5个型和犬种布鲁氏菌、林鼠布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌各1个型[1],其中,引起人类疾病的主要有羊、牛、猪和狗布鲁菌。布鲁氏病遍布全球,是一个在世界范围内发生的流行性疾病,严重危害流行地区的人们健康和带来巨大的经济损失。全世界160多个国家和地区每年向WHO报告发病例数50万例[2]。中国从2000年起布鲁氏菌病疫情出现上升趋势,并且由原来主要局限在几个重要的牧区,近几年全国几乎所有省(自治区、直辖市)都有病例报道,人间发病率达到1.55/10万[3]。由于布鲁氏菌的病原学和致病特点,大量的活菌操作都被要求在生物安全三级实验室中进行[4],而关于布鲁氏菌的常规的细菌学鉴定,比如生化、生物学等鉴定都涉及大量活菌的操作,但国内的实际是三级实验室只有极少数实验室装备。因此,近年发展起来的基于聚合酶链反应(PCR)检测与鉴定布鲁氏菌的一些方法引起了大家的重视,与常规的检测方法比较,它需要的菌量少,并且不要求活菌,极大地降低了实验室感染概率,在生物安全二级实验室就可以进行。本文就目前基于PCR检测和鉴定布鲁氏菌的方法的研究和应用综述如下。

1 普通PCR检测技术

普通PCR根据布鲁氏菌的一段特异性核酸序列来设计引物,PCR检测布鲁氏菌最早是由Baily报道的,目前使用得比较多的目标基因有16SrRNA、BCSP31、omp2[4-8]等。选择不同的目标基因对检测的结果敏感性和特异性都有影响[9],有研究以16SrRNA、BCSP31、omp2作为目标基因进行比较,研究它们在血中做PCR检测布鲁氏菌的灵敏度和特异度差异,得出16SrRNA检测相对灵敏度是最低的,而BCSP31检测是最敏感的[10]。

2 多重PCR检测技术

多重PCR在微生物检测中的应用一般是设计多种病原微生物的特异性引物,在同一PCR反应管进行PCR扩增,可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染。Probert等[11]对用多重PCR检测布鲁氏菌进行了研究,但只能区分少数的几种布鲁氏菌。García-Yoldi等[12]根据布鲁氏菌不同种的特异性DNA片段设计引物,一共设计了8对引物,多重PCR扩增后按照电泳片段多寡和片段大小不同可以对6种布鲁氏菌都进行区分。刘志国等[13]将多重PCR与荧光PCR技术结合进行研究,建立的方法有灵敏度高、快速、易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。

3 AMOS-PCR检测技术

布鲁氏菌的AMOS-PCR检测是基于细菌染色体上的重复插入序列IS711的发现建立的,IS711对布鲁氏菌属是特异性的,而且在绝大多数布鲁氏菌种的染色体上至少有一个拷贝序列[14]。有研究者[15-16]根据布鲁氏菌 不同种IS711位 置的差异设计引物,一共设计了5条引物,建立了AMOS-PCR检测布鲁氏菌的方法:即将一个共用引物锚定在这段IS711序列上,其他4条不同的引物分别选在与IS711序列邻近的DNA的特异序列中,通过4个PCR反应的扩增产物的大小和有无来鉴别布鲁氏菌种。这种方法能检测牛布鲁氏菌的生物1、2和4型,羊布鲁氏菌的所有3种生物型,猪布鲁氏菌的生物1型和绵羊布鲁氏菌的所有生物型[15]。后来为了区分布鲁氏菌疫苗株S19和RB51,另外3条引物被增加到上述的AMOSPCR方 法 中[16-17]。AMOS-PCR 能 检 测 大 部 分 布 鲁 氏 菌 到种[15]。

4 细菌基因组重复序列PCR(Rep-PCR)检测技术

研究发现细菌基因组中存在一些特殊的重复序列,常见的包括基因外重复回文系列(repetitive extragenic palindromic,REP)、肠杆菌基因间重复一致序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)和BOX[18-19],BOX是 DNA序列中一种特异的功能序列,它们在菌株、种、属水平上进化过程有相对保守性,但分布有差异。Rep-PCR通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列,然后对电泳条带进行分析比较,来揭示基因组间的差异,在细菌演化和流行病学研究中是一种重要的手段[20]。在3种重复序列中,根据BOX重复原件设计引物的Rep-PCR对细菌的区分能力是最高的[21]。

5 多位点可变数目串联重复序列分析技术(MLVA)

基因组的研究发现细菌基因组中分布着一种可变数目串联重复序列(variable-number tandem-repeat,VNTR),VNTR有一定的序列和重复的特点。MLVA的原理即根据研究的需要选取多个VNTR位点设计引物,通过多个PCR扩增这些位点序列,依据电泳结果,必要时也可以通过测序得出VNTR大小、位点的不同以达到菌株分型的目的。Flèche等[22]用筛选了15个微卫星串联重复序列等位标记对已知的236株布鲁氏菌菌株进行了分析,分出来的簇和原本的生物型符合度高。并且他们将15个等位标记分成两组,一组由8个标记组成,能够将布鲁氏菌区分到种;另外一组由7个标记组成,有更高的分型能力,能够对种进行分型。由于MLVA可以数字分析的优势,有研究机构建立了在线的布鲁氏菌MLVA数据库,巴黎第11大学于2007年建立了基于MLVA分型方法的在线数据库(http://mlva.u-psud.fr/brucella/),访者可以免费浏览和查询该数据库[23]。在线数据库的应用将极大地方便全球布鲁氏菌分析的交流和比较。

以上几种基于PCR建立的检测和鉴定布鲁氏菌的方法比较,普通PCR只能够将布鲁氏菌鉴定到属;多重PCR能够将布鲁氏菌鉴定到一些种,但多重PCR对DNA提取的纯度和PCR反应体系的条件要求较高,否则将出现假阴性现象[12];AMOS-PCR能够检测几种重要的布鲁氏菌种,已经能应付绝大多数的疫情处理[15];Rep-PCR主要应用于布鲁氏菌的分型研究,但由于操作人员和实验室条件的变化对实验结果影响比较大,应用上受到一定的限制;MLVA技术比较容易标准化,结果容易解释,对种和型都能够进行分析,而且易于各实验室的交流比较,显示了很好的发展前景[24]。

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