臧 矫综述，邢 华审校

（扬州大学兽医学院，江苏扬州225009）

帕金森病实验研究中多巴胺及其合成酶测定方法的研究进展

臧 矫综述，邢 华审校

（扬州大学兽医学院，江苏扬州225009）

帕金森病； 黒质； 多巴胺； 神经元； 多巴胺合成酶； 测定方法； 综述

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种以运动症状如静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓和姿势不稳为主要临床表现进行归类的神经系统变性疾病，多发于中老年人。其主要病理表现是黑质多巴胺能神经元进行性变性而造成其靶结构纹状体的多巴胺（dopamine，DA）含量下降。在世界范围内，1%～2%的65岁以上老年人患有PD，80岁以上患病率增加到4%[1]。美国罗切斯特大学 Dorsey等推算，PD人数在2030年会翻一番，达930万人。根据WHO报道，全球400万例患者中有170万例在中国，PD已成中老年人的“第三杀手”[2]。DA作为下丘脑和脑垂体腺中的一种关键神经递质，选择性作用于抑制性神经元，如若DA合成不足，兴奋性胆碱能神经元处于相对优势，则引发PD[3]。而在目前PD的治疗方案中，不论是药物治疗、手术治疗、细胞移植治疗或是基因移植治疗，普遍以恢复脑内DA水平来达到控制病情的效果。因此，DA含量及其合成相关影响因素在PD研究中起到重要作用。本文主要针对近年来对脑内DA含量及影响DA合成酶测定方法的相关研究进展作一综述，为后续研究工作的开展提供参考和借鉴。

2 PD脑内DA的变化

PD是一种缓慢发生的选择性中脑黑质DA能神经元丧失和纹状体DA含量显著减少的老年神经系统退行性疾病[4]。DA拮抗剂和激动剂的应用研究表明，DA受体在运动控制中起到重要作用。通常情况下，激动剂可提高DA的运动功能，而拮抗剂的作用则相反。PD就是由于DA能神经元变性引起黑质-纹状体通路内DA显著减少所致[5]。

2.1 PD相关基因与DA 1997年，祖籍希腊、生活在美洲的家族，被确诊为是α-synuclein蛋白基因突变患者，其壳核和尾状核的18F DA摄入明显减少，提示黑质纹状体系统的DA神经元丧失与α-synuclein蛋白基因突变有关。同年，经连锁分析后，科学家们将另一基因定位在第6号染色体上，不久后该基因被克隆，命名为“Parkin”基因。该基因的生物活性尚不清楚，只发现在功能上与泛素相近。后有研究报道，Parkin蛋白广泛存在于脑组织中，尤其集中分布在中脑黑质和纹状体内，在携带该基因突变的患者大脑中，普遍存在Parkin蛋白的严重缺失现象。经研究发现，Parkin基因的外显子缺失和点突变可能会干扰泛素介导的蛋白水解通路，其结果导致中脑黑质神经元的变性死亡，进而影响DA的生成，但确切致病机制仍有待进一步研究[6]。随着研究的深入，除α-synuclein蛋白基因与Parkin基因以外，还有5种基因也逐渐被确定与PD有关，分别是NCHL1基因、NURRR1基因、DJ-1基因、PINK1基因和LRRK2基因。

2.2 PD病理生理与DA PD以黑质纹状体DA神经元进行性丧失及DA缺少为特征。近年来，在锥体外系统内神经元相互作用的许多其他神经元也被发现参与PD的病理生理过程。其病理变化主要位于脑黑质部位，肉眼可见黑质体积缩小，色素消失，镜检黑色素及神经细胞减少达59%，伴反应性神经胶质减少，从偏侧PD综合征者症状可见，患者对侧纹状体DA明显减少。因此，纹状体DA含量减少被认为是PD最重要也最为恒定的生化变化，且根据临床数据显示，DA含量减少超过70%即出现PD症状[7]。

2.3 PD与多巴胺能神经元免疫因素 据文献报道，早在1978年，陈远宾等[8]就提出免疫学异常可能参与PD的发病。在PD患者脑脊液中发现，抗多巴胺能神经元抗体，PD患者的血浆和脑脊液能抑制培养多巴胺能神经元的生长功能。Yuan等[9]研究表明，PD患者血清免疫球蛋白（IgG）可引起黑质的相对特异性损伤，实验从5例PD患者和10份对照血清纯化得到IgG后，注入成龄大鼠右侧黑质内，4周后发现PD IgG组注射侧酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫阳性细胞数较对侧下降50%，而对照组下降18%，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Beal等[10]的研究是把经DA自身氧化产物醌修饰后的卵清蛋白分别与PD血清和对照组血清反应，其阳性率结果显示，PD组为7%（n=21），对照组为0（n=21）。以上实验结果提示，PD患者血清中存在醌修饰卵清蛋白的抗体，并且可能参与或加重PD的炎性反应。

3 DA及其检测方法

DA作为下丘脑和脑垂体腺中的一种关键神经递质，参与兴奋及愉悦的信息传递，也与上瘾相关，因此又被称为“大脑奖赏因子”或“爱情分子”。

3.1 DA发现历程 DA在过去被怀疑具有生化作用，是合成去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）的中间产物，直到1957年有学者才提出，其除了作为NE生物合成的前体外，还有不相关独立的外周生理作用。

1958年首先报道纹状体内 DA占全脑含量的70%，且与NE分布不同，并提出DA可能是独立的脑内神经递质。20世纪60年代，PD被发现是黑质致密区DA能神经元的变性所致，临床上用左旋多巴（L-dopa）治疗取得好的疗效。通过大量研究，DA被确定为中枢神经递质[13]。

3.2 DA合成过程 中脑合成的DA是由酪氨酸（tyrosine，Tyr/Y）先通过TH转化生成左旋多巴，再经芳香族氨基酸脱羧酶（aromaticL-aminoaciddecarboxylase，AADC）的作用，左旋多巴脱羧生成DA。TH在整个过程中充当限速酶，四氢蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）是第一步酶促反应的辅酶。BH4由GTP生成，GTP环化水解酶-Ⅰ（GTP cyclohydrolaseⅠ，GCH-Ⅰ）又是BH4的第一步酶促反应的限速酶[14]。

3.3 生物样品中DA的检测方法 DA的化学名称为4-（2-乙胺基）-1，2-苯二酚。生物样品中DA的含量测定方法主要有以下几种：分光光度法、荧光法、高效液相色谱（HPLC）法、电位溶出法和酶联免疫吸附试验（ELISA）法。其中，HPLC又根据检测方法不同，可细分为：HPLC-质谱连用法、HPLC-电化学法、RP-HPLC-紫外检测法、RP-HPLC-荧光检测法等。

3.3.1 分光光度法 分光光度计采用可产生多个波长的光源，通过系列分光装置产生特定波长的光源，光线透过测试样品，部分光线被吸收，获得样品的吸光值（OD值），进而转化成样品的浓度。该方法灵敏度高、仪器设备简单、操作简便、快速、应用广泛。但因其准确度相对不高，灵敏度达不到研究要求，所以在近年来的研究性实验中少有采用。

3.3.2 荧光光度测定 荧光光度测定的原理是DA与Tb3+在pH 6.5～6.8条件下能形成较强的荧光络合物，其激发峰在300 nm，发射峰在494 nm和545 nm处。利用生成的荧光络合物吸收特征波长的光后发射荧光，通过测定其荧光强弱来进行定量分析。该方法灵敏度高（比分光光度法高1～3个数量级），选择性高，线性范围广，且测定结果与斑点形状无关[15]。

3.3.3 HPLC HPLC又分为紫外检测法、电化学法和荧光检测法等。

3.3.3.1 紫外检测法 DA具紫外吸收，化学结构中有2个邻位酚羟基，可采用反相HPLC测定，其紫外吸收波长λmax为280 nm。HPLC-紫外检测方法测定操作简便、灵敏度良好、结果准确可靠。普通实验室一般配备紫外检测器，但因电化学检测器价格昂贵，较少配备，对生物样品中DA的测试难以开展。因此，紫外检测法适用于普通实验室进行脑组织DA的分析检测[16]。

刁娟娟等[17]在用HPLC-紫外检测DA含量时，测得正常小鼠脑纹状体内DA含量为（13.6±3.6）μg/g（n=8）。实验同时考察了样品的稳定性，结果显示，DA供试品在室温下不稳定，4℃仅可保存24 h。提示在检测DA含量的实验中，标准品应现配现用，样品也应在提取后的当天（24 h内）检测完毕，不宜长时间保存后再进样。

3.3.3.2 电化学法 DA结构中2个邻位酚羟基苯环上电子密度高，极易氧化成邻醌，具有电活性，可被检测。电化学法选择性非常高，只有容易被氧化还原具有电活性的物质，才能被检测出。缺点是对设备要求较高[18-19]。

魏丽丽等[20]在用HPLC-电化学法检测时结合微透析技术，从生物活体内进行动态微量生化取样，透析得到的样品直接经在线注射器进入HPLC系统进行测定。测得大鼠纹状体细胞外液中DA含量为（389.84± 39.92）ng/μL（n=5）。该方法具有在清醒活体动物机体上连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点。

3.3.3.3 荧光检测法 荧光检测器是根据化合物具有荧光性质进行分析，选择性高，只对荧光物质有响应。灵敏度也相对较高，适合于多环芳烃及各种荧光物质的痕量分析，也可用于检测不发荧光但经衍生反应可发荧光的物质。DA与Tb3+形成荧光较强的络合物，易被检测。实验采用反相HPLC结合荧光检测法，梯度洗脱，尤其适合同时测定脑组织中多种神经单胺类递质含量的实验，样品预处理及测定操作步骤简单、灵敏度高、色谱峰分离效果极佳，且洗脱时间短。

鲁燕侠等[21]使用荧光检测器检测，单泵流速梯度洗脱，测得正常小鼠脑内左旋DA含量为（110.33±10.56）ng/g。张雷等[22]同样采用该检测方法测得正常小鼠脑内DA含量为（2.35±0.56）μg/g（n=8）。

3.3.4 电位溶出法 电位溶出法以玻碳和汞膜为电极、化学修饰电极还原计时电位溶出，测定DA含量。该方法仪器简单，灵敏度高，实验过程中NE、抗坏血酸等均不干扰DA的测定，有好的选择性[23]。

4 DA合成酶及其检测方法

促进DA合成的酶主要有：酪氨酸3-单氧化酶（TH）、氨基酸脱羧酶（AADC）和GCH-Ⅰ。

4.1 DA合成酶

4.1.1 TH 该酶在大脑黑质中含量较高，作为一种含铁的多功能单氧化酶，其功能主要依靠分子氧和辅酶BH4来实现。TH是一个四聚体结构，它具有高度的特异性。Grima等[24]发现，人类的TH共有4种异构体，包括hTH1、hTH2、hTH3、hTH4，其中hTH1的活性较高。TH是催化合成儿茶酚胺类神经递质的首步，是DA合成的限速酶。TH的催化活性与铁离子的浓度相关，在TH发挥作用的过程时，铁离子经氧化后被BH4还原，因此，DA能神经元是否产生氧化应激作用，铁离子的浓度成为了一个重要的因素。TH通过催化亚区和调节亚区相互协调发挥作用，继而合成儿茶酚胺类神经递质[25]。

Gautier[26]将人类TH通过HSV载体移植到PD大鼠的纹状体中，改善了大鼠的PD症状，使其脑内TH活性增强，DA合成增加，转圈行为也得以改善。Goldman[27]曾经将经TH修饰的肌细胞移植入PD模型大鼠的纹状体内，使得PD大鼠的行为学变化得到明显改善。

4.1.2 AADC 该酶是催化脱去某种氨基酸的羧基，生成对应胺的裂解酶的总称。AADC作为氨基酸脱羧酶家族成员之一，对其他芳香族左旋氨基酸也具有脱羧作用，因此，在哺乳动物组织中又被称为色氨酸脱羧酶、5-羟色氨酸脱羧酶或多巴胺脱羧酶（dopadecarboxylase，DDC）。

1938年，AADC首次从哺乳动物的肾脏中分离出来；直到1986年，才报道了果蝇AADC基因的核酸序列[28]；1987年，又从人嗜铬细胞瘤克隆出AADC的cDNA并由 cDNA核酸序列得出完整的氨基酸酶序列[29]；1989年，从神经细胞克隆出的人AADC cDNA全长由1932个碱基对组成，其中有1个开放性阅读框架，编码480个氨基酸残基的蛋白[30]。

刘军等[31]将AADC转基因骨骼肌细胞脑内移植后，实验组PD模型大鼠旋转行为较前明显改善，并可持续15周以上，该实验证明，在补充AADC后，脑内纹状体区DA含量显著提高。

4.1.3 GCH-Ⅰ GCH-Ⅰ是BH4合成途径中的限速酶，BH4又是AADC的必需辅助因子。因此，GCH-Ⅰ活性的缺陷将影响苯丙氨酸代谢和单胺类神经递质的合成[32]。

研究表明，PD患者纹状体内，不仅TH和AADC水平下降，GCH-Ⅰ也有显著降低。在TH、AADC或TH结合AADC基因治疗PD大鼠的基础上，如若加入GCH-Ⅰ工程细胞进行复合基因治疗，将能起到更佳的治疗效果[33-34]。

4.2 促DA合成酶的检测方法 目前DA合成酶检测方法主要有检测蛋白和基因2种思路。组织染色法、蛋白质印迹（Western blotting）法、考马斯蓝等检测蛋白表达水平的变化，原位杂交法、RT-PCR法及Q-PCR法等能检测基因的表达情况。以上方法能分别从定性、半定量及定量的多层次对DA合成酶进行检测。正确的选择、搭配使用适当的检测方法，能使研究结果更加充实、可信。鉴于DA合成酶中TH发现时间较早、含量较高，国内外对其研究较全面，下面以TH为例，介绍促DA合成酶的若干检测方法。

4.2.1 组织染色法 在对PD模型大鼠显微结构进行检测中，常用苏木精-伊红（HE）染色法、Nissl染色法、免疫组织化学法、荧光免疫组织化学法等。

4.2.1.1 HE染色法 潘琪[35]在观察蛋白酶体抑制剂诱导大鼠黑质变性伴包涵体形成及运动行为改变的实验中，采用HE染色法观察黑质致密部病理改变。结果显示，模型鼠损毁侧黑质致密部神经元数目减少，呈变性改变，神经元细胞膜不完整、结构不清，细胞质内可见嗜伊红包涵体，胶质细胞增多。

4.2.1.2 Nissl染色法 许耀刚[36]在对MPTP损伤小鼠慢性PD模型的制作与评价实验研究中，用Nissl染色法考察了小鼠黑质DA能神经元的损伤程度。其模型组和正常组在该方法下并未体现显著性差异。封华[37]在评价用MPTP诱导C57BL/6j小鼠PD临床前期模型时发现，Nissl染色结果显示，模型组小鼠中脑黑质内可见散在固缩的神经元，正常对照组小鼠中脑黑质内神经元结构正常。

4.2.1.3 免疫组织化学法 TH免疫组疫组织化学法结果作为PD模型的典型病理检测指标，在PD实验研究中具有重要参考价值。季正剑[38]在骨髓间充质干细胞移植治疗PD的实验研究中发现，模型损毁侧黑质致密带内神经元数目较正常对照组显著减少，达90%以上，神经细胞几乎消失，残存细胞萎缩，阳性细胞数明显减少。损毁侧纹状体内无明显TH阳性细胞，表明损毁侧纹状体内DA能神经元已变性坏死。

4.2.1.4 荧光免疫组织化学法 在电针对震颤麻痹大鼠中脑黑质和肾上腺髓质TH的影响实验中，罗明富等[39]发现，健侧黑质内可见有TH阳性细胞，电针组的TH阳性细胞数明显多于对照组，而且荧光亮度也比对照组强。

4.2.2 Western blooting 该法是利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测样品中特定蛋白的方法。刘晓志等[40]在脑内移植神经生长因子（NGF）诱导的PC-12细胞治疗大鼠PD的研究实验中，提取模型动物中脑黑质蛋白进行TH蛋白检测，结果发现，损毁侧黑质区TH蛋白免疫反应明显低于模型动物正常侧黑质区，对照组中正常大鼠左右脑不存在显著差异，对照组动物和模型动物正常侧黑质区不存在显著差异。在研究左旋多巴对PD模型大鼠结肠TH和突触核蛋白表达的影响实验中，毕树立等[41]用Western blooting法检测PD模型大鼠、左旋多巴治疗大鼠的结肠TH表达水平，结果发现，与正常对照组比较，模型组、治疗组各时间点结肠TH阳性细胞及蛋白表达均明显减少，与模型组比较，治疗组各时间点结肠TH阳性细胞及蛋白表达均增多。

4.2.3 原位杂交法 为了进一步研究PD细胞凋亡分子病理机制，刘新红等[42]利用原位杂交法检测PD大鼠TH mRNA在黒质细胞的表达变化。采用针对大鼠Parkin靶基因的mRNA序列作为探针，其探针均经地高辛标记。结果显示，TH mRNA表达在模型鼠术后3 d损伤侧黑质中开始减少，7 d组阳性细胞数量明显下降，14 d组可见少量残存的TH阳性细胞，28 d组又开始见很少量的TH阳性细胞，各组与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

4.2.4 RT-PCR法 RT-PCR是PCR的一种广泛应用的变形，用于多种基因的检测。在DA合成相关酶基因联合治疗PD大鼠模型的研究实验中，鲁玲玲等[43]用含重组病毒AAV-TH、AAV-AADC和AAV-GCH-Ⅰ的上清液对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行体外感染；将携带有TH、AADC和GCH-Ⅰ基因重组假病毒颗粒感染BMSCs后植入PD模型大鼠损伤侧纹状体内。再通过RTPCR方法在移植后12周检测上述3种基因。结果显示，在LacZ组中未见目的基因表达，而hTH+hGCH-Ⅰ组、hTH+hAADC组和三基因组中分别获得与预期条带相当的hTH、hGCH-Ⅰ、hAADC基因表达产物。其中阳性神经元主要分布在针道周围的纹状体内，部分阳性神经元分布于同侧胼胝体及皮质区。

4.2.5 Q-PCR法 何珊[44]在PD模型大鼠脑内TH表达变化的实验研究中，采用荧光定量PCR方法测定大鼠脑内TH mRNA水平。实验通过正常大鼠脑内TH mRNA表达水平的变化研究模型大鼠脑内TH mRNA表达水平的变化，进而分析TH mRNA水平与PD的关系。结果表明，正常大鼠左右脑TH基因的表达无显著差异，术后3周的成功PD大鼠损毁侧脑TH mRNA的表达量约是对照侧脑的57.4%；术后6周的成功PD大鼠损毁侧脑THmRNA的表达量约是对照侧脑的31.7%，术后8周，成功PD大鼠损毁侧脑TH mRNA的表达量约是对照侧脑的39.9%。

综上所述，DA及其合成限速酶与PD息息相关。在PD模型大鼠脑内纹状体中，DA及其相关限速酶含量显著低于正常水平。通过补充外源左旋多巴，DA其相关的合成限速酶阳性细胞及蛋白表达增多；同样，经导与DA合成相关限速酶的基因治疗后，DA合成量随之增加，病情在行为学上也得以改善。此规律对PD的临床治疗起到指向性作用。正确且科学地选择DA及其合成酶的检测方法，也必将助力于PD的实验开展。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.014

A

1009-5519（2015）21-3244-05

2015-07-06）

国家自然科学基金资助项目（31172284）。

臧矫（1990-），女，江苏常州人，在读硕士研究生，主要从事比较分析医学帕金森病动物模型的研究；E-mail：365086405@qq.com。

邢华（E-mail：184937646@qq.com）。