杨 文，沈 文，郭海英，陈冬梅，陈凯丽，孙延鸣

(石河子大学 a 动物科技学院，b 生命科学学院，新疆 石河子 832003)

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全长的克隆及序列分析

杨 文a，沈 文a，郭海英a，陈冬梅a，陈凯丽b，孙延鸣a

(石河子大学 a 动物科技学院，b 生命科学学院，新疆 石河子 832003)

【目的】 克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列，为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】 采集巴什拜羊外周血液，从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA 序列设计兼并引物，用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列，再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物，分别扩增出5′和3′端目的片段，分别回收克隆的目的基因片段，再与pMD18-T载体连接，分别转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，将重组菌测序后进行拼接，获得巴什拜羊BPI基因全长 cDNA 序列，并对序列进行分析。【结果】 克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922 bp，其中开放阅读框为1 452 bp，共编码483个氨基酸；BLAST分析表明，巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%，91%，78%，74%，64%，61%，58%，53%和50%；氨基酸进化分析显示，巴什拜羊首先与绵羊聚为一类，其次与牛聚为一类，该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】 通过RACE方法成功地克隆了1 922 bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列，且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。

巴什拜羊；BPI基因；杀菌/通透性增强蛋白；cDNA 末端快速扩增

杀菌/通透性增强蛋白(Bactericidal permeability increasing protein, BPI)是存在于机体中性粒细胞内的一种阳离子抗菌肽，是中性粒细胞内多种抗菌成分中惟一能够直接对革兰氏阴性菌发挥毒性作用, 且对游离的脂多糖(LPS) 具有中和作用的物质[1]。BPI最早发现于1978年，Weiss等[2]利用离子交换和凝胶过滤层析法从人的中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中分离纯化而得到天然BPI蛋白质，因其能通过增强革兰氏阴性菌外膜的通透性，逐渐使其失活而得名。已有报道证实，BPI具有杀菌、中和内毒素、促进补体活化、调理吞噬功能、抑制血管生成、抑制炎性介质释放、抗原虫、抗真菌等作用，对革兰氏阴性菌肺炎和急性肺损伤也有显著的保护作用[3-9]。

巴什拜羊属于牛科绵羊属，是新疆地方优良品种，具有早熟性好、生长发育快、耐寒、耐粗饲、体质结实、抗病力强等优点[10-11]。目前对BPI的研究主要集中在人、鼠和猪上，国内外尚未见有关羊BPI的研究报道。因此，本研究以新疆巴什拜羊为研究对象，对其BPI基因全长cDNA序列进行克隆及序列分析，以期为进一步研究巴什拜羊BPI基因的分子结构、基因表达和生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 5只巴什拜羊，均购自塔城裕民县巴什拜羊繁育基地。

1.1.2 菌种及主要试剂 大肠杆菌DH5α由石河子大学生化实验室提供，酶焦磷酸二乙酯(DEPC)购于Sigma公司，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (批号：PR14596) 购自Clontech公司，3′-Full RACE Core Set试剂(批号：6106)盒购自宝生物工程有限公司，TRIzol(批号：15596-026)购自Invitrogen公司，中性粒细胞分离液(批号：20110218)购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，DNA凝胶回收试剂盒(批号：1101G06)、质粒提取试剂盒(批号：1011G23)购自上海捷瑞生物工程有限公司，pMD 18-T Vector载体(批号：CK5201AA)购自宝生物工程有限公司，DNA MakerⅠ、dNTP、TaqDNA酶均购自北京天根生化科技有限公司，试验用Hank’s液、PBS溶液参考分子克隆实验指南配制[12]。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 参照GenBank中牛的BPI基因序列，设计PCR引物B1和B2，其中B1的序列为：5′-GGCAAYTTTGACCTGAG-3′；B2的序列为：5′-TTCAGTTCCAGGAGCAG-3′。

根据扩增序列以及SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 和TaKaRa3′-Full RACE Core Set Ver.2.0的要求，利用 Primer 5.0 软件设计RACE引物。其中3′RACE特异性引物GSP1的序列为:5′-GCGGCTCTGAGTCTGGGCTAT-3，巢式PCR引物NGSP1的序列为:5′-TGACCCTGACT-CGGGCCACTCCACT-3′；5′RACE特异性引物GSP2的序列为: 5′-CAGAAAGGTTCAAGTTCATCTCAAGC-3′，巢式PCR引物NGSP2的序列为:5′-GTTCAAGTTCATCTCAAGCAGGA-3′。

以上引物均由华大基因合成。

1.2.2 中性粒细胞的分离及其RNA的提取 颈静脉采集巴什拜羊血液，按照中性粒细胞分离液说明书中的方法分离外周血中性粒细胞。用TRIzol法抽提巴什拜羊中性粒细胞总RNA。提取的总RNA用无菌DEPC水溶解，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用分光分度计测定OD260和OD280，于-80 ℃保存备用。

1.2.3 cDNA第一链的合成 以巴什拜羊中性粒细胞提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。

(1)3′-RACE cDNA第一链的合成。反应体系为RNA样品1 μL，3′RACE Adaptor 1 μL，5×M-MLV Buffer 2 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)0.25 μL，Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)(200 U/μL)0.25 μL，RNase Free dH2O 4.5 μL。反转录条件：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。

(2)5′-RACE cDNA第一链的合成。反应体系为RNA样品3 μL，5′-CDS引物1 μL，SMART Ⅱ A寡聚核苷酸接头1 μL，加RNase Free dH2O至5 μL，混匀，瞬时离心，70 ℃水浴加热2 min，立即放入冰水浴中冷却2 min，稍离心，将溶液收集到管底。在反应管中加入反转录酶缓冲液2 μL、DTT(20 mmol/L) 1 μL、dNTP(10 mmol/L) 1 μL、PowerScript反转录酶1 μL，混匀，瞬时离心后于42 ℃温浴保温90 min，加20 μL用Trinine-EDTA缓冲液稀释的反转录产物，作为RT-PCR反应的模板。

1.2.4BPI基因cDNA序列3′末端的扩增 按照3′-Full RACE Core Set试剂盒说明，以新疆巴什拜羊中性粒细胞RNA反转得到的3′-RACE cDNA第一链为模板进行PCR反应。PCR反应体系为：cDNA 2 μL，1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 8 μL，GSP1(10 μmol/L)2 μL，3′-RACE Outer Primer(10 μmol/L)2 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+Free)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，TaKaRa LATaq(5 U/μL)0.25 μL，dH2O 28.75 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物，用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.5BPI基因cDNA序列5′末端的扩增 按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明书，以新疆巴什拜羊中性粒细胞RNA反转得到的5′-RACE cDNA第一链为模板，以试剂盒附带的UPM引物和GSP2引物进行PCR。PCR反应体系为：5′-RACE-Ready 2.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 1 μL，TaqPolymerase(2.5 U)1 μL，10×UPM 5 μL，GSP2 1 μL,dH2O 34.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，72 ℃延伸3 min，5个循环；94 ℃变性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5个循环；94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5个循环；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，20个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.6 3′末端cDNA和5′末端cDNA PCR产物的克隆 将3′末端和5′末端PCR产物经电泳鉴定正确后，按照DNA胶回收试剂盒说明书分别切胶回收，回收产物与pMD18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜。挑取白色菌落于LB液体培养基中过夜培养后抽提质粒。经PCR鉴定后，阳性克隆菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.7 序列分析 用DNAMAN软件对所得序列进行拼接测序，并应用该软件预测其RNA的二级结构；应用DNAstar对克隆所得的巴什拜羊BPI基因与其他物种BPI的核苷酸序列进行一致性分析。

2 结果与分析

2.1 巴什拜羊中性粒细胞及RNA的检测

颈静脉采集巴什拜羊血液，抗凝血经中性粒细胞分离液分离后，试管中液体分为4层，其中第3层为中性粒细胞。用枪头吸出中性粒细胞后，用TRIzol法抽提中性粒细胞总RNA，用紫外分光光度计检测所提取的总RNA质量，计算OD260/OD280=1.9，证明所提总RNA的质量较好，无降解和蛋白质污染；用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RNA，可明显看见2条清晰的条带，分别是28S、18S (图1)，28S和18S的浓度比约为2∶1，说明所提取的RNA完整性较好。

2.2 BPI基因cDNA 3′末端的扩增

图2显示，BPI基因的3′-RACE扩增出724 bp的条带。将其克隆到pMD18-T载体后，经PCR鉴定正确。

2.3 BPI基因cDNA 5′末端的扩增

图3显示，BPI基因5′-RACE扩增出1 487 bp的条带。将其克隆到pMD18-T载体后，经PCR鉴定正确。

2.4 BPI基因cDNA 序列分析

通过DNAMAN软件将3′-RACE和5′-RACE序列进行拼接后，得到巴什拜羊BPI基因1 922 bp 的全长cDNA序列(GenBank登录号:KF523344)，其核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列见图4。

图4 巴什拜羊BPI基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列
Fig.4 Nucleotide sequences and the deduced amino acid sequence of Baishibai sheepBPIgene

巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列的开放阅读框为1 452 bp；起始密码子为ATG，位于54～56 bp；终止密码子为TGA，位于1 506～1 508 bp；共编码483个氨基酸，编码区两侧翼分别具有 5′-UTR 54 bp(1～54 bp)和 3′-UTR 416 bp(1 507～1 922 bp)，在 poly(A)尾前32 位(1 795～1 800 bp)出现加尾信号ATTAAA。

ProtParam程序显示，BPI基因cDNA序列开放阅读框内碱基的使用情况为：A有330个，占22.73%；G有356个，占24.52%；T有327个，占22.52%；C有439个，占30.23%。

2.5 BPI基因RNA二级结构的预测

应用DNAMAN软件预测BPI基因的RNA二级结构，图5表明，其RNA二级结构由数个三叶草型茎环结构交联组合而成。

将巴什拜羊BPI基因测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，结果显示，巴什拜羊BPI基因核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾的一致性分别为99%，91%，78%，74%，64%，61%，58%，53%和50%。将克隆得到的巴什拜羊BPI基因的氨基酸序列用DNAstar

软件分别与上述9种动物BPI基因的氨基酸序列进行分析，结果(表1)表明，巴什拜羊与绵羊、牛BPI基因氨基酸序列的一致性在91%以上，与虎鲸、野猪的一致性在70%以上。由BPI基因系统进化树分析结果(图6)可知，巴什拜羊首先与绵羊聚为一类，其次跟牛聚为一类，与实际生物学分类情况相符。

图5 巴什拜羊BPI基因RNA的二级结构预测
Fig.5 Secondary structure prediction of Baishibai sheepBPIRNA

3 讨 论

本研究利用RACE方法克隆了新疆巴什拜羊的BPIcDNA基因序列，其全长为1 922 bp，其中开放阅读框(ORF)为1 452 bp，共编码 483个氨基酸，随后对其基因序列和RNA的二级结构进行了分析。本研究进行时GenBank尚未见有关羊的BPI基因序列登录，故本试验只好根据牛BPI基因序列设计简并引物，根据已知的BPI部分序列设计RACE引物，利用RACE技术分别扩增出BPI5′端和3′端序列，最后经测序后拼接而成完整的巴什拜羊BPI全长cDNA序列，结果表明用此方法克隆未知基因序列是可行的。

在本试验即将完成时，GenBank上发布了绵羊BPImRNA的预测序列(GenBank登录号:XP_004014614)，该序列是通过GNOMON程序对绵羊13号染色体基因组序列(GenBank登录号:NW_004080176.1)进行分析预测得到的BPImRNA基因序列。预测的绵羊BPI基因mRNA序列全长 为1 827 bp，开放阅读框1 452 bp。本试验结果表明，巴什拜羊与已登录的绵羊BPI基因编码序列有5处核苷酸差异，相似性为99.66%，有3处氨基酸差异，相似性为99.38%。进一步分析差异基因，表明巴什拜羊编码序列第327位处于密码子第3位的T变为C，第369位处于密码子第3位的C变为T，这2处核苷酸的改变并未导致氨基酸的变化，巴什拜羊编码序列第964位处于密码子第1位的A变为G，即编码第322位氨基酸的密码子由ACC变为GCC，从而导致了氨基酸由苏氨酸 (Thr)转变为丙氨酸 (Ala)；第1 132位处于密码子第1位的T变为C，即编码第378位氨基酸的密码子由TCC变为CCC，导致氨基酸由丝氨酸 (Ser)转变为脯氨酸 (Pro)；第1 258位处于密码子第1位的G变为A，即编码第420位氨基酸的密码子由GTC变为ATC，导致氨基酸由缬氨酸 (Val)转变为异亮氨酸 (Ile)。氨基酸的这些改变，是否会导致蛋白结构的改变以及功能的不同，尚有待进一步研究。

本试验在运用RACE技术扩增巴什拜羊BPI基因cDNA 5′ 末端时，始终扩增不出目的片段。查阅文献得知，mRNA某些区段形成的二级结构会阻碍反转录的正常进行，得不到完整的cDNA第一链，常常缺少其5′末端序列[13-14]。笔者使用DNAMAN软件预测了牛BPI基因RNA的二级结构，结果显示其是由多个三叶草型茎环交联形成的复杂牢固结构。牛和羊均为反刍动物，在分类学上为同一科的动物，其基因结构相似性较高，推断本试验使用RACE技术扩增不出巴什拜羊的BPI5′ 端序列，可能正是由于该基因mRNA某些区段形成了复杂牢固的二级结构，阻碍了反转录的正常进行，从而导致试验失败。因此，在重新进行试验时，考虑到RNA二级结构对反转录的影响，利用高温有利于打开RNA二级结构这一特点，将试剂盒说明中的反转录反应条件增加了一个步骤，即先在70 ℃处理5 min然后再骤冷处理，最后终于成功扩增出5′末端序列片段。

本研究应用RACE技术首次成功克隆了巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列，并对BPI基因进行了简单的信息分析，从而对巴什拜羊的BPI有了进一步的认识。然而要更深入地了解BPI蛋白的结构和功能，还需要对其构建表达载体进行表达，以进一步开展巴什拜羊BPI的相关功能研究，揭示BPI蛋白在免疫中发挥的作用。

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Cloning and sequence analysis of Bactericidal/Permeability-Increasing protein gene in Xinjiang Baishibai sheep

YANG Wena,SHEN Wena,GUO Hai-yinga,CHEN Dong-meia,CHEN Kai-lib,SUN Yan-minga

(aCollegeofAnimalScienceandTechnology,bCollegeofLifeSciences,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China)

【Objective】 To reveal the bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) in Bashibai sheep and improve the study of its structure and function,theBPIcDNA was cloned from Bashibai sheep by homologous cloning and rapid amplification cDNA ends (RACE).【Method】 This study used Bashibai sheep as the research object.First,merger primers were designed according to the cDNA sequence ofBostautusBPIgene from the GenBank andBPIgene segment was amplified by RT-PCR.The sequencing results were compared with known results.Second,according toBPIgene sequence,new primers were designed to extend the segments from the 5′ and 3′ ends,respectively.Then the cloned fragments were recycled and ligated into pMD18-T vector before being transformed into DH5α.At last,masculine clones were detected and sequence analysis was conducted.【Result】 The porcineBPIcDNA cloned was 1 922 bp in length (GenBank accession No:KF523344) and the open reading frame was 1 452 encoding 483 amino acids.BLAST analysis shows that homology ofBPIamino acids sequence between Bashibai sheep and those ofOvisaries,Bostaurus,Orcinusorca,Susscrofa,HomosapiensandOryctolaguswere 99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53% and 50%,respectively.Molecular phylogenetic tree analysis shows that Bashibai sheep assembled toOvisaries,followed by bos,which was identical to the biological classification.【Conclusion】 Sheep BashibaiBPIcDNA with length of 1 922 bp was successfully cloned using RACE method and the phylogenetic tree result was consistent with the biological classification.

Bashibai sheep;BPIgene;bactericidal/permeability-increasing protein(BPI);rapid amplification cDNA ends (RACE)

2013-11-20

国家自然科学基金项目(31160525)

杨 文(1989-),女,新疆石河子人,在读硕士,主要从事兽医临床学研究。E-mail:yangwen2695@126.com

孙延鸣(1965-),男，新疆石河子人，教授，博士，主要从事临床兽医学研究。E-mail:sym@shzu.edu.cn

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.028

S826.2

A

1671-9387(2015)05-001-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.028.html