汪晨净，南晓东，裴淑艳，马艳庆

(1. 西北民族大学医学院, 甘肃兰州730030; 2. 武警甘肃总队医院重症医学科,甘肃兰州730050)

内皮素与动脉粥样硬化

汪晨净1，南晓东2，裴淑艳1，马艳庆1

(1. 西北民族大学医学院, 甘肃兰州730030; 2. 武警甘肃总队医院重症医学科,甘肃兰州730050)

近年来的研究表明内皮素能参与多种疾病的病理生理过程，尤其对心血管疾病(如：动脉粥样硬化、高血压、高血脂、心律失常等)起重要作用.文章仅就内皮素在动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)中的作用作综述.

内皮素；动脉粥样硬化；细胞因子

1 内皮素与内皮素受体

内皮素(endothelin, ET)是1988年日本学者Yanagisawa等从猪的主动脉内皮细胞分离纯化出来的血管活性肽[1]，ET-1 是纤维母细胞、血管平滑肌细胞和其他细胞的有丝分裂原，具有十分广泛的生物活性，是目前已知最强和持续时间最久的缩血管物质之一，并具有促血管平滑肌细胞增殖和调节体内有关活性物质释放的作用.

1.1 内皮素的生物学特点

经过近20年的研究，人们已逐步明晰内皮素家族主要包括ET-1、ET-2和ET-3三种异形肽[2]. 它们的结构和功能有很多相似之处，都由21个氨基酸组成，分子内皆含有2个二硫键和C末端6个保守氨基酸残基，是维持ET活性最为重要的因素. 而三种ET的基因定位、组织表达特异性、与受体的结合及生物活性等不尽相同，ET-1的生物活性最强，主要在内皮细胞及平滑肌细胞(SMCs)中有较多表达，在其他组织(如脑、肾、肺和子宫等)也有少量表达[3]；ET-2的生物活性居中，表达以肾脏和小肠居多，来源细胞尚不清；ET-3的生物活性最弱，主要在神经系统表达. 在功能方面，三种ET都具有较强而持久的缩血管作用，它们收缩强度依次为ET-1 ≥ET-2 > ET-3[2].

1.2 ET-1的生物合成、来源及分布

目前认为，ET的生物合成首先是ET基因被激活并在核内转录生成核不均RNA(HnRNA)，经剪切后合成为相应的ET前体原mRNA(ppET-1mRNA).随后ppET-1mRNA进入胞浆，在粗面内质网翻译、合成为ppET-1，再经一种内肽酶水解释放出无活性的内皮素前体(bigET)，最后通过内皮素转换酶(endothelin-converting enzyme, ECE)(可能是一种独特的金属蛋白酶)水解色氨酸-缬氨酸之间肽键，并释放具有生物活性的ET. ECE是ET合成过程中的限速酶，ECE抑制剂可以阻止ET的合成，减少ET对身体的不利影响[4]. ET在体内的降解很快，ET-1 mRNA半衰期为15～20 min，血浆半衰期为4～7 min，ET的主要是清除部位是肺和肾. 许多因素如血栓素、血管紧张素Ⅱ、生长因子、细胞因子、缺氧及机械张力等均可增加ET的合成和释放，而一些具有扩血管作用的血管活性物质和前列腺素、心钠素、肝素等可减少ET的产生.

1.3 ET受体

ET只有与靶细胞膜上的内皮素受体(endothelin receptor, ETR)结合后才能发挥生物效应. 现已证实，ETAR、ETBR及ETCR为已知的三种ETR亚型，前两者主要分布在人体内，ETCR主要分布于非哺乳动物体内. ETAR对各种内皮素的亲和力不同，ETAR与ET-1的亲和力最高，其次为ET-2，最弱为ET-3，ETBR与ET三个成员有相等的亲和力，ETCR对ET-3及ET-1有较强的亲和力[5]. ETR在不同组织的分布比例及作用亦有不同，ETAR主要存在于心血管系统如血管平滑肌细胞、心肌细胞和脑血管细胞，介导血管收缩、平滑肌增殖和心钠素的分泌等；ETBR又可分为B1和B2亚型.ETB1R主要表达于内皮细胞，与血管舒张剂(如：内皮舒张衍生因子、一氧化氮、前列环素I2等)的释放相耦联；ETB2R主要表达于VSMCs，与血管收缩机制相耦联. ETCR是ET-3的选择性受体，主要分布在神经元细胞，直接起神经介质的作用. 研究表明，ETR的表达可受多种因素的调节，缺氧、各种组织生长因子、cAMP、雌激素可上调ETAR，而利钠素、AngII可上调ETBR. 反之，ET、AngII和某种组织生长因子可下调ETAR，而cAMP、儿茶酚胺可下调ETBR[6].

2 内皮素在动脉粥样硬化中的作用

近年来大量研究表明， As是一种以血管内皮损伤为始动环节的慢性炎症反应性疾病. 动脉壁内皮细胞SMCs与活性氧族(reactive oxygen species, ROS)及氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)发生反应，以及大量炎症因子激活，构成As最显著的病理特征. ET-1作为一种内源性常效、强效的血管收缩剂，不仅能引起持久的缩血管作用，还具有氧化修饰低密度脂蛋白，趋化白细胞、单核细胞以及促SMCs表型转化和迁移、增殖的作用，提示ET-1可能介导了As的炎症性损伤过程，与As的发生、发展及转归密切相关.

2.1 内皮素与血管收缩

ET-1结合其受体，通过与G蛋白偶联的磷脂酶C(PLC)，生成ROS信号分子如：二酰基甘油(diacylglycerol, DG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)，继之生成四磷酸肌醇(IP4). DG可活化PKC，改变离子通道的通透性，激活电压依赖性钙通道，激活磷脂酶A(PLA)，Na+/H+交换，关闭ATP敏感性钾通道等，最终加强Ca2+介导的细胞收缩过程.IP3能促进细胞内肌浆网释放Ca2+，而IP4则开放细胞膜Ca2+通道使外钙内流，最终使细胞内Ca2+浓度大幅度升高. Ca2+与钙调素结合后，激活肌反应蛋白轻链激酶等，引起Ca2+介导的平滑肌收缩.另据报道ET-1可通过激活G12或G13激活Rho/Rho-激酶系统，最终通过调节平滑肌的收缩敏感性而促进血管收缩，因而ET-1是迄今所知作用最强和持续时间最久的缩血管活性多肽. As时，血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)损伤，ET释放增加导致血浆ET-1含量增高，当ET-1增高到一定程度时，ET-1在Ca2+介导下通过DG、IP3及IP4，引起冠状动脉收缩痉挛，并进一步损害内皮细胞. 临床资料显示，As患者血浆中有高浓度的ET-1，且其ET-1升高水平与As患者受损冠状动脉数目及冠脉痉挛狭窄的程度呈正相关. 此外，ET-1还具有强烈心脏正性收缩作用和正性频率作用，可直接增加As患者的心肌耗氧量，并进一步加重心肌的缺血、缺氧，提示血浆ET-1水平升高也是As所致心肌梗死发病的重要机制之一[7,8].

2.2 内皮素与氧化型低密度脂蛋白

2.3 内皮素与炎性细胞及炎症介质

ET-1是一种多功能细胞因子，它与As病理过程中的多种炎性细胞如白细胞、单核细胞及内皮细胞等的激活与趋化及炎症介质的释放直接相关.

2.3.1 趋化吸引中性白细胞及单核细胞

Wright等在实验中发现[16]，ET-1是人中性白细胞的有效趋化因子，其最大趋化反应浓度为10-7M，Leu6-Met7-Asp8是ET-1的有效趋化片段. 但ET不能引起中性白细胞的呼吸爆发，脱颗粒和花生四烯酸的代谢. 研究表明[17]，ET-1还能引起单核细胞的趋化，且单核细胞的趋化值随ET-1浓度的增加而增加，此作用与Ca2+相关，使用Ca2+通道阻滞剂心痛定，硫氮卓酮和异搏定能明显减少单核细胞的趋化能力，抗炎药物阿司匹林和消炎痛也能部分减弱其趋化活性.

2.3.2 刺激细胞黏附分子表达

白细胞与血管内皮、固有组织细胞的黏附是影响As炎症发生、发展的重要环节. 炎症反应时，白细胞与内皮细胞的黏附过程首先是白细胞的L-选择素与内皮细胞的相应配体相结合，引起白细胞在内皮层表面滚动，随后是白细胞上的整合素(CD11/CD18)与内皮细胞上的免疫球蛋白样黏附分子(如ICAM-1、VCAM-1)结合，使白细胞固定、变形，形成牢固的黏附，继而才发生跨膜、游走等过程，因而黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)是介导As过程的关键分子. As研究表明[18～20]，ET能在ETAR或ETBR介导下，通过不同途径，引起主动脉内皮细胞、心肌细胞及纤维母细胞样滑膜细胞等靶细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1 表达增加，致使白细胞浸润、聚集，并与内皮细胞及血管壁细胞黏附，进而介导As过程中血管炎性反应.

2.3.3 刺激细胞因子释放

研究表明，ET-1在刺激单核细胞过氧化物产生的同时，还能增加ROS下游靶分子细胞因子如粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、TGF-β、IL-6、IL-8及TNF-α等重要前炎症因子的基因表达[21, 22]. 其中，IL-6能引起肝细胞产生急性反应期蛋白及VECs功能损伤. TNF-α是进一步激活中性白细胞和内皮细胞，引发As炎症级联效应的重要介质. 而IL-8则是嗜中性、嗜碱性白细胞等炎细胞的有效趋化激活因子. 这些因子的产生能进一步放大及加重As过程中的血管炎症反应.由此可见，无论通过如何具体的信号途径，ET诱导的炎性细胞的活化、炎症介质的产生是As发生、发展过程中的重要环节. 另外，早期的实验已证实，人中性白细胞能以浓度依赖的形式迅速将bigET转变成ET；细胞因子IL-1也能以时间、浓度依赖性地增加培养内皮细胞产生ET-1的能力，提示内皮素与白细胞、内皮细胞、细胞因子之间在As炎症的发生中构成了一复杂的网络关系.

2.4 内皮素对VSMCs增殖的影响

As早期，血液单核细胞迁入动脉内膜并激活、分化成为巨噬细胞，摄取脂质后，成为泡沫细胞，病变发展为脂质条纹. 随后中膜SMCs迁入动脉内皮下间隙，增长并合成胶原，使病变成为纤维斑块. 因此VSMCs的异常迁移与增殖是As的一个最主要特征. 而VECs、VSMCs、单核/巨噬细胞和成纤维细胞等通过合成和分泌ET，继之诱导ROS及其信号分子的产生起了重要的作用. ET-1是VSMCs的促有丝分裂剂，实验显示将10-7M ET-1加入SMCs的培养液中，4 d 后可使细胞数增加2倍，DNA合成增加7倍. 先前的研究发现，动脉损伤后ET释放规律与细胞增殖关系甚为密切，即随着SMCs数目的增多ET-1的释放也增多. ET-1对VSMCs的促增殖作用具有浓度依赖性，此种作用可能是通过癌基因诱导的[23]. 核内癌基因是ET-1促SMCs增殖作用的早期促发因素. 原癌基因斑点杂交实验证明，ET-1明显促进培养的家兔主动脉SMCs c-fos表达. 实验还证明，ET-1对SMCs的促增殖作用与血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及TGF等多种生长因子有协同作用，同时应用ET-1和各种生长因子时，其促增殖效应可比它们单独应用时的总和增高1倍以上，表明ET-1和多种生长因子对SMCs有协同促增殖作用. 另外，PDGF、TGF、Ang II等和ET-1本身也可促进ET-1基因的表达，协同促进ET-1的合成和分泌，促进SMCs增殖，进一步加重As的发展.

3 内皮素在动脉粥样硬化中的信号转导

内皮素在As中的上述不同效应主要通过不同受体亚型介导，内皮素与受体结合激活的细胞内信号转导途径主要包括G蛋白偶联途径[24]、磷脂酶C途径及酪氨酸蛋白激酶介导的信号通路.

3.1 内皮素受体与G蛋白偶联

内皮素受体是一种与鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联的膜受体，首先它必须与G蛋白结合，形成内皮素-受体-G蛋白复合物，使G蛋白α亚单位与一分子GTP结合，并与其β及γ亚单位分离，继而激活或抑制特异性效应器系统(效应器酶或离子通道)，最终产生各种生物学效应. 内皮素受体为一变构效应器，配体与之结合部位不同形成不同的变构效应器，进而与不同的G蛋白亚型相偶联，使G蛋白催化GTP水解. 内皮素-1通过百日咳不敏感的G蛋白(Gq/G11)，激活Ca2+依赖性一氧化氮(NO)途径，刺激cGMP升高，cGMP可引起血管舒张等生物学效应.而内皮素-3通过百日咳敏感的G蛋白(Gi/Go)的不依赖Ca2+依赖性一氧化碳(CO)途径，抑制腺苷酸活化酶(AC)，使cAMP减少，进而调控SMCs的收缩及离子运动. 另外，内皮素受体对离子通道的激活可能是直接通过激活G蛋白或是通过第二信使或蛋白激酶对通道蛋白的共价修饰而起作用.

3.2 内皮素受体与磷脂酶C途径

内皮素通过受体与G蛋白Gq亚型结合，激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PLC)，使磷脂酰肌醇水解成IP3和DG. IP3可促使Ca2+从贮存库释放至肌浆，胞浆中Ca2+浓度升高伴随钙调蛋白变构、肌球蛋白轻链激酶活化、神经递质释放、最终导致血管收缩并调节一些功能如分泌、释放递质和激活酶类.DG可激活蛋白激酶C(PKC)，并参与SMCs的生长、分化、离子运动及收缩致敏的调节.

3.3 内皮素受体与酪氨酸蛋白激酶介导的信号通路

蛋白酪氨酸磷酸化在生长因子受体活化的信号传递途径中起重要作用. 目前研究显示各种血管活性肽对VSMCs具有生长因子作用[25]. 内皮素激活的酪氨酸蛋白激酶介导的信号通路主要有经Ras蛋白活化丝裂原蛋白激酶途径及激活磷脂酰肌醇-3激酶途径.

3.3.1 经Ras蛋白活化丝裂原蛋白激酶途径

研究表明,内皮素可通过激活G12或G13激活Ras蛋白，进而活化Ras的效应器—Raf家族的蛋白激酶. Raf的异构体C-Raf、B-Raf及A-Raf是丝裂原蛋白激酶(MAPK)超家族级联的初始激酶. Raf家族的蛋白激酶激活，可使MAPK超家族(ERK1/2、p38MAPK及JNK)激活，进而参与SMCs的生长和分化.

3.3.2 磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途径

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)也是Ras蛋白一种效应器，内皮素活化Ras蛋白后，可使PI3K激活，PI3K可激活蛋白激酶B(Akt).Akt具有刺激细胞生长、促进蛋白的合成以抑制细胞凋亡的作用.

4 结论

综上所述，ET-1作为一种强有力的缩血管多肽，与心脑血管疾病特别是与As发病的关系日益受到关注. ET能通过诱导ROS产生，活化ROS相关信号分子而发挥其收缩血管和刺激前炎症介质(如IL-6、IL-1、TNF等)的释放作用，进而造成血管内皮的损伤. 血管活性物质释放、血管内皮受损又会增加ET合成和释放.ET-1浓度增高进一步加重了血管内皮的损伤，故而形成恶性循环，在As发生发展过程中起重要作用. ETR和ECE可能成为未来药物作用的新靶点.

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2015-11-20

2014年国家自然科学基金项目资助(No. 81360490).

汪晨净(1975—), 女,博士,副教授，主要从事心血管药学方面的研究.

R543.31

A

1009-2102(2015)04-0064-05