张天宇,杜从林,迟宝进,胡存利,罗振国

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯 154003)

增龄对大鼠阴茎海绵体内CSE及H2S含量变化的影响①

张天宇,杜从林,迟宝进,胡存利,罗振国

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探讨不同月龄大鼠阴茎海绵体内CSE、H2S含量的变化规律，进一步明确增龄中ED发生的机理。方法:选择2月龄、8月龄、16月龄及24月龄雄性Wistar大鼠各10只，按月龄不同分成四组(A、B、C、D组)。于相同环境下给予相同饲料喂养四周后第1日给予阿朴吗啡100μg/kg于每只大鼠的颈项背部皮下注射，然后持续观察60min并记录勃起次数。第2日在给予电刺激3V和5V、2ms、25Hz下分别测定每只大鼠的ICP/MAP。切取各组大鼠阴茎海绵体组织，分别测定H2S和CSE含量。结果：随月龄增加，大鼠海绵体内H2S和CSE含量均下降，大鼠阴茎勃起次数减少。结论：增龄对于海绵体组织内CSE、H2S水平有显著影响，内源性H2S在大鼠阴茎勃起过程中起促进阴茎勃起的作用，阴茎海绵体组织内CSE表达减弱导致H2S含量减少是老年性ED的发病原因之一。

阴茎海绵体;胱硫醚-γ-裂解酶;勃起功能障碍

随男性年龄的增加,其阴茎勃起功能逐渐衰退，勃起功能障碍(ED)出现的几率渐渐增加[1]。增龄与男性勃起功能障碍的关系是多因素的[2]，因此对于深入研究勃起障碍的原因可以有助于提高男性人群的生活质量。硫化氢(H2S)是一种新发现的气体信号分子，它可以通过自由扩散的方式在细胞间传递信息，从而调节血管平滑肌舒张[3～5]。Srilatha等发现H2S在阴茎勃起的整个过程中起到重要的信使传递作用[6]。活体组织细胞依靠两种关键酶合成H2S：胱硫脒-β-合成酶(CBS)、胱硫脒-γ-裂解酶(CSE)，但在海绵体组织中以后者起主导作用。本课题通过对不同月龄大鼠海绵体内CSE及H2S水平变化规律的研究，旨在进一步研究年龄增长过程中发生勃起功能障碍的原因。

1 材料及方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究对象：

Wistar大鼠40只，购于黑龙江省兽医科学研究所，随机选取2、8、16、24月龄雄性、健康、状态良好的，每组体重相差50g以内，每个月龄组10只，按相同月龄分为一组，依次记为A、B、C、D组。各组大鼠置于佳木斯大学动物实验中心的同一实验室的相同环境内喂养4周，给予相同的饲料和饮水。

1.1.2 仪器及主要试剂：小鼠抗大鼠CSE抗体购自于上海阳光试剂有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG购自于上海瑞齐生物科技有限公司，阿扑吗啡(APO)购自于Sigma公司，RM6240型多导生理信号采集处理系统、分光光度计由佳木斯大学实验中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1APO诱导大鼠阴茎勃起：实验开始前对大鼠喂养四周，以达到实验最佳状态。配制APO：将生理盐水及维生素C溶液加入至5mgAPO中，APO最终配制浓度达到10μg/mL, 维生素C达0.2mg/mL。参照Heaton等人[7]的实验方法，皮下注射APO于每只大鼠的颈部，以100μg/kg的剂量注射。每只大鼠皮下注射APO完毕时，立即从笼子下方应用摄像机统计它们勃起次数和打呵欠情况，时间持续30min。若大鼠龟头充血或阴茎勃起角度大于90°，则记勃起1次，统计30min内出现的次数。若大鼠有典型的不随意张大口且同时伴有大幅度的呼吸情况，则记打呵欠1次。

1.2.2 海绵体内压(ICP)测定：观察勃起次数后，为测定大鼠海绵体内压，我们参考了李付彪等人[8]的方法，以戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉,其注射用剂量为35mg/kg。为监测大鼠动脉血压,手术采用颈前正中切口切开，然后进行右侧颈动脉血管插管以测定平均动脉压(MAP)。接下来沿着大鼠腹中线切开大鼠下腹部,于前列腺的右后外侧紧贴前列腺边缘寻找到阴茎勃起神经。然后将阴茎部分坐骨海绵体切除,暴露出右侧阴茎脚，把24G针头插至海绵体脚内，针头内装有250U/mL肝素，24G针后连接导管，然后导管与压力转换器相连后同电脑控制仪相连接，来测定阴茎海绵体内压(ICP)。ICPmax/MAP的变化用RM6240型多导生理信号采集处理系统来记录，给予相应参数的电刺激，电刺激参数为：3V、5V，2ms，25Hz，连续单刺激持续1min，停止5min后可重复电刺激，本实验分别记录第1、7分钟的3V和5V电刺激下的ICPmax/MAP。

1.2.3 阴茎海绵体组织内H2S含量及生成率测定：将大鼠除去包皮、阴茎头、尿道海绵体等，分离出阴茎海绵体组织，洗净血液后制成匀浆，取0.5mL匀浆加入10mmol/L的L-半胱氨酸20μL，2mmol/L的5-磷酸吡哆醛20μL、0.9%NaCl溶液30μL于37℃水浴当中反应，时间维持30min; 向之前上述反应体系内加入250μL1%(W/V) 乙酸锌溶液、250μL10%(W/V)的三氯乙酸溶液，于37℃水浴锅中水浴维持60min以使反应终止;向上一步完成的反应体系内加入20mmol/L对苯二铵盐酸盐溶液133μL及30mmol/L三氯化铁溶液133μL，待反应时间持续20min后，放入波长为670nm的紫外分光光度计中进行检测，检测它们的吸光度。根据硫化氢浓度标准曲线从而计算海绵体组织内的H2S水平。组织内H2S含量用nmol/mg表示[9]。

1.2.4 免疫荧光法测定阴茎海绵体组织CSE的含量：通过激光共聚焦检测利用CSE抗体标记的大鼠阴茎海绵体组织，观察CSE分布特点，采用Image-ProPlus6.0处理软件测定各组大鼠阴茎海绵体CSE荧光强度，从而间接计算出CSE在阴茎组织内相对含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 勃起功能及ICP

不同月龄组大鼠平均勃起次数、呵欠次数及ICPmax/MAP(3V、5V)的测定结果，见表1。

表1 不同月龄组大鼠平均勃起次数、呵欠次数及ICPmax/MAP(3V、5V)的变化

各组相互比较，3V下ICP/MAP示t(A,B)=4.14，t(B,C)=5.47，t(C,D)=6.00；5V下ICP/MAP示t(A,B)=8.36，t(B,C)= 11.35，t(C,D)= 7.78，各组间差别均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 大鼠海绵体内CSE、H2S含量及生成率测定

不同月龄组大鼠海绵体内CSE及H2S水平的变化，见表2。

表2 不同月龄组大鼠阴茎海绵体内CSE、H2S含量和生成率的变化

各组相互比较，H2S含量示t(A,B)=5.67，t(B,C)= 5.67，t(C,D)=8.64，CSE(IA)示t(A,B)=5.12，t(B,C)=6.36，t(C,D)=5.08，各组间差异均有显著性(P<0.05)。

3 讨论

勃起功能障碍(ED)为男性一种临床比较多见的性功能障碍疾病，会使患者本人及其家属陷入巨大的痛苦之中。在ED的各项病因中，年龄已被公认为是高危因素，随着年龄的增长，ED的发病率逐步增长。阴茎海绵体内的神经调控是通过神经介质发挥效应，NO、CO与H2S已被证实是体内重要的细胞信使分子[10]。目前的研究已经发现阴茎勃起生理信号主要的传导途径为NO-cGMP途径，最终导致细胞内的钙离子减少引起平滑肌的舒张，但是目前增龄过程中发生ED的具体机制尚未明确。近年来研究已经证实老龄大鼠阴茎海绵体内NOS表达下调[8]。但增龄过程中H2S/CSE体系的改变目前国内外研究均较少，因此本实验采用2月龄、8月龄、16月龄、24月龄的大鼠进行H2S/CSE体系的相关研究，以进一步明晰增龄过程中ED发生的具体机制。

目前常用的检查动物勃起功能的方法有雌雄动物交配实验、APO诱导实验及电刺激阴茎海绵体神经测定ICP实验等。但是由于交配实验的影响因素较多，故本实验采用另外2种方法联合检查。APO诱导实验能够测定动物勃起次数的变化进行记录，属于从质的方面研究动物的勃起功能，为了客观精确的了解阴茎勃起潜能的变化，我们同时也采用电刺激阴茎海绵体神经实验观察记录ICPmax/MAP的变化，从而在量变上评价动物的阴茎勃起功能。通过对不同月龄的大鼠勃起功能实验发现，随月龄的增加，大鼠勃起次数依次减少、ICPmax/MAP(3V、5V)逐渐下降，A组(2.60 ±0.84，0.49±0.06，0.67±0.02)最高，D组(0.50 ±0.52，0.19±0.04，0.28±0.03)最低，各组间大鼠的勃起次数及海绵体内压的数据进一步行两两比较显示各组间差异均具有统计学意义(P<0.05)，而各组打呵欠次数虽有差别但无显著性(P>0.05)。从而证实随着大鼠增龄，其勃起功能逐渐下降。

阴茎勃起有着十分复杂的机制，是在神经、内分泌及心理效应等综合调控下所产生的血流动力学改变的结果[11]，在勃起的整个过程里，海绵体平滑肌的舒张起到非常主要的作用。研究已经证实，继NO、CO之后H2S作为第三种内源气体信号分子，对于海绵体的舒张起着非常关键的作用。H2S可通过ATP敏感的K+通道参与调节阴茎勃起，已有的ZhaoW等人[5]的研究结果表明,H2S可以在不需要第2信号分子参与的条件下，直接增强KATP通道的电流，使血管平滑肌细胞膜超极化进而调节血管平滑肌的松弛。Hosoki等人[12]曾经在相关文章报道过，小剂量H2S能够起到增强NO对于血管平滑肌细胞的舒张功能。另外H2S还可与睾酮、CO以协同作用等方式来舒张阴茎海绵体血管平滑肌。H2S在活体中主要有2种形式存在：H2S和NaHS。NaHS在体内与H2S形成了动态平衡。内源性H2S在哺乳动物体内的产生主要有三种酶催化，是胱硫醚-γ-裂解酶(cystanthionine-γ-lyase，CSE) 、胱硫醚-β-合成(cysta-nthionine- -β-synthetase，CBS) 、半胱氨酸氨基转移酶(cysteineaminotransferase)。CSE主要存在于各种血管组织及平滑肌中，而CBS主要存在于神经系统内[3]。CSE作为阴茎组织中合成H2S的主要关键限速酶，其活性的高低直接影响着H2S含量的多少。

本实验结果显示随着月龄的增长，大鼠阴茎海绵体平滑肌组织中H2S的含量及生成率逐渐降低，A组为(87.73±3.01, 4.29±0.37)最高，D组为(59.67±1.99, 1.06±0.08)最低，各组数据行两两比较，其差异均有统计意义(P<0.05)；海绵体内CSE含量也依次减少，A(327.77±36.64)>B(255.57±25.35)>C(188.56±23.10)>D(135.43±21.90)组，且各不同组间差别均有显著性(P<0.05)。这说明，增龄过程中，阴茎海绵体内CSE的表达逐渐减弱，CSE的含量下降，导致阴茎海绵体组织内H2S的生成减少，H2S含量降低，最终致使老年大鼠阴茎海绵体血管平滑肌的舒张能力下降，从而引起ED的发生。 综上所述，增龄对于阴茎海绵体组织内CSE、H2S水平有显著影响，内源性H2S在大鼠勃起过程中起促进阴茎勃起的作用，增龄过程中阴茎海绵体组织内CSE表达下调导致H2S含量减少是老年性ED的发病原因之一。但增龄过程中CSE表达下调的具体机制以及H2S信号通路在阴茎勃起过程中的具体机制有待进一步研究探讨。

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黑龙江省卫生厅课题，编号：2013-229；佳木斯大学校级自然科学类青年项目，编号：Sq2013-025。

张天宇 (1972～)男，黑龙江绥化人，在读硕士研究生，副主任医师。

罗振国(1964～)男，黑龙江宝清人，学士，教授，硕士研究生导师。E-mail:luozhenguo8888@163.com。

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