龚菊梅，张慧，谢媛媛，陈卫东，王义明，罗国安

川芎质量综合评价研究

龚菊梅1,2，张慧2，谢媛媛2，陈卫东1，王义明2，罗国安2

目的：综合考察国产川芎药材质量。方法：用HPLC法测定32批川芎药材中洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸和藁本内酯等5种指标成分的含量，并考察药材TLC鉴别和饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分和醇浸出物等药材常规理化项目。结果：除购自新绿色药业有限公司山川芎药材未检测出洋川芎内酯A，其他样品均能检测出5种指标成分的色谱峰，但含量差异较大，在川芎药材常规理化试验结果中，水分含量和醇浸出物含量符合药典要求，但总灰分测定中有4批大于6%的含量限度，酸不溶性灰分中有2批大于2%，有2批未检测出酸不溶性灰分。结论：实验结果表明不同基原、产地和药用部位的药材间品质差异较大。本实验为川芎药材综合评价体系的建立提供理论和实验依据。

川芎；含量测定；阿魏酸；藁本内酯；洋川芎内酯；高效液相色谱法

川芎是伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）的干燥根茎，具有活血行气，祛风止痛之功，为活血化瘀中药复方制剂中常用药材；主要化学成分为内酯类、有机酸和酚类化合物[1,2]。研究表明：川芎嗪配伍阿魏酸可保护心肌细胞缺血再灌注大鼠心肌，明显降低其血清CK[3]；川芎内酯A可保护缺血/复氧损伤心肌微血管内皮，提高细胞存活率，减轻损伤[4]；川芎生物碱蒿本内酯对子宫平滑肌痉挛具有解痉作用[5]。

为客观有效表征川芎药材质量，保证其临床用药的有效性和安全性，本研究在2010年版《中国药典》川芎项下检测项目基础上，建立了川芎药材多指标成分TLC薄层鉴别方法，进行川芎药材水分、总灰分、酸不溶灰分和醇浸出物鉴别等常规理化项目测定，同时使用HPLC法测定32批药材中洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸和藁本内酯等5种指标成分含量，以期为川芎药材综合评价体系的建立提供理论和实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪（系统控制器Prominence CBM-20A，低压二元梯度泵，SPDM20A检测器，Prominence SIL-20A自动进样器，高效液相色谱工作站 LCsolution等）；恒温控制箱（天津谱祥科技有限公司，型号：M500）；RUC-5200型超声波清洗器（上海睿祺电子设备有限公司）；PB303-N型电子天平（d=1mg，梅特勒-托利多公司）；Milli-Q Synthesis 超纯水纯化系统（美国密理博公司）。

1.2 对照品

阿魏酸（四川维克奇生物科技有限公司，批号201005，纯度大于98%）、洋川芎内酯A（四川维克奇生物科技有限公司，批号201009，纯度大于98%）、Z-藁本内酯（四川维克奇生物科技有限公司，批号201103，纯度大于98%）、洋川芎内酯I（鼎瑞化工有限公司，纯度大于98%）和3-正丁烯苯酞（西域化工，纯度大于95%）。

1.3 试剂

甲苯（北京第二化工厂，分析纯）；盐酸（北京第二化工厂，分析纯）；硝酸银（北京第二化工厂），冰醋酸（北京第二化工厂，分析纯），乙醇（北京第二化工厂，分析纯）；甲醇（J.T.Baker，色谱纯），水为Milli-Q超纯水。

1.4 药材

川芎对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120918-200809），本研究所用32批川芎药材产地均来自四川省的不同地区，经鉴定均为伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）的干燥根茎，其中两批山川芎也为川芎的一种。32批川芎药材来源见表1 。

2 方法

2.1 3种指标成分TLC鉴别

按照2010年版《中国药典》（一部）川芎质量标准项下薄层色谱鉴别法鉴定[6]。

对照品溶液的配制：取欧当归内酯A、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含0.1mg的溶液（置棕色量瓶中），作为对照品溶液。

2.2 川芎饮片水分、总灰分、酸不溶灰分、醇浸出物测定

水分、总灰分、酸不溶灰分按照2010年版《中国药典》（一部）川芎质量标准项下相关方法测定（附录IX H、K）。醇浸出物按照2010年版《中国药典》（一部）附录X A醇溶性浸出物测定法中热浸法，以乙醇为溶剂进行测定。

2.3 阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、3-正丁烯苯酞HPLC含量测定

2.3.1 色谱条件和系统适应性 色谱柱：Grace Allitma C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样：20μL；流动相：0.2%冰醋酸-水（A）-甲醇（B）；梯度洗脱（0-3min, 32% B; 3-60min, 32%～85% A; 60-65min, 85%～95% A)。理论板数按阿魏酸计算应不低于6000。

2.3.2 对照品溶液的配制 取阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、3-正丁烯苯酞对照品适量，加甲醇制备成每1mL各含阿魏酸0.502mg、洋川芎内酯I 2mg、洋川芎内酯A 1mg、藁本内酯2mg、3-正丁烯苯酞0.493mg的混合对照品储备液。精密吸取适当体积的对照品储备液，分别制备成浓度范围为阿魏酸：6.275～251.0μg．mL-1、洋川芎内酯I：10.00～400.0μg．mL-1、洋川芎内酯A：6.250～200.0 μg．mL-1、藁本内酯：25.00～800.0μg．mL-1、3-正丁烯苯酞：12.325～493.00μg．mL-1的6个不同浓度水平的对照品标准溶液，分别精密吸取上述溶液20 μL，各进样2次。

2.3.3 供试品溶液的配制 取川芎中粉0.5 g（过4号筛）， 精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入30 mL50%乙醇，超声处理45 min （40 kHz, 500W），放冷，定容至50 mL，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3.4 测定法 精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液20μL，按“2.3.1”项下的色谱条件进样分析，按外标法测定阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、3-正丁烯苯酞含量。

3 结果

表1 实验药材样品来源一览表

18 川芎 鑫宝堂药业有限公司 饮片 四川敖平 2010年12月19 川芎 吉林敖东 饮片 四川 2005年12月20 川芎 敖平 饮片 四川敖平 2009年12月21川芎 重庆 药材 四川 2009年12月22 川芎 鑫宝堂药业有限公司 药材 四川都江堰 2010年12月23 川芎 鑫宝堂药业有限公司 饮片 四川敖平 2009年12月24 川芎 鑫宝堂药业有限公司 饮片 四川敖平 2010年12月25 川芎 北京同仁堂 饮片 四川 2010年12月26 川芎 重庆桐君大药房 饮片 四川 都江堰 2010年12月27 川芎 成都荷花池 饮片 四川 2010年12月28 川芎 敖平 饮片 四川 敖平 2010年12月29 川芎 新绿色药业有限公司 药材 四川敖平 2010年12月30 川芎 重庆和平大药房 饮片 四川 2010年12月31 川芎 鑫宝堂药业有限公司 饮片 四川 2005年12月32川芎 浙江 饮片 四川 2009年12月

3.1 3种指标成分的TLC鉴别及饮片的水分、总灰分、酸不溶灰分、醇浸出物测定结果

32批药材中欧当归内酯A、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A等TLC鉴别结果见图1，对照品相应位置上均检测到相应斑点，常规理化测定结果见表2。

图1 32批川芎药材254nm下薄层色谱图

表2 川芎药材的测定结果

22 药材/川芎 5.37 4.42 0.34 40.7 5.06 4.74 0.94 0.79 22.17 33.69 23 药材/川芎 6.42 4.34 0.56 38.7 1.42 8.09 0.95 1.61 48.37 60.45 24 川芎片/川芎 8.33 4.33 0.08 22.6 3.87 6.24 1.13 2.08 50.46 63.78 25 饮片/川芎 7.92 4.29 0.44 31.9 2.15 4.94 0.73 1.67 27.89 37.39 26 饮片/川芎 7.20 4.27 0.75 26.0 2.64 8.18 0.84 1.21 36.03 48.91 27 饮片/川芎 6.79 4.27 0.31 28.3 2.30 10.85 0.71 1.88 46.4 62.14 28 药材/川芎 5.14 4.25 0.80 32.7 2.22 16.91 0.86 2.54 54.44 76.98 29 药材/川芎 8.72 4.23 - 33.3 2.71 2.47 0.55 0.63 9.776 16.14 30 饮片/川芎 5.98 4.02 0.31 26.4 4.95 4.20 1.08 1.46 29.12 40.81 31 川芎片/川芎 7.87 3.76 0.69 26.6 3.57 4.36 1.12 1.32 23.53 33.89 32 饮片/川芎 4.00 3.40 0.36 27.8 1.12 5.73 0.91 1.13 24.68 33.57 Max 10.2 7.94 3.16 40.7 7.28 16.91 1.44 2.54 68.54 79.34 Min 2．82 3．40 0．17 16．7 1．12 2．47 0．44 0．63 9．776 16．14 RSD 28．6 19．1 74．5 23．3 49．9 50．96 23．37 32．31 41．19 35．07 Average+ 6．49± 4．93± 0．85± 29．6± 3．20± 5．66± 0．95± 1．44± 32．93± 44．19± SD 1．82 0．93 0．62 6．27 0．29 0．53 0．04 0．09 2．48 2．82

3.2 川芎药材中5种指标成分HPLC含量测定结果

3.2.1 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”各对照品溶液，按测定法进样分析。以对照品浓度对峰面积进行线性回归。5种成分的回归方程、相关系数、线性范围见表3。

表3 川芎药材中5种指标成分线性关系考察结果

3.2.2 精密度实验 精密吸取川芎样品，连续进样6针，进样量20μL，计算洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸、藁本内酯含量，得到其含量RSD值分别4.67%、2.46%、5.43%、4.64%、3.72%，均小于6.0%，说明仪器的精密度良好。

3.2.3 稳定性实验 精密吸取室温下放置的川芎样品溶液，每隔3个小时进同一针样品，进样6次，进样量为20μL，结果洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸、藁本内酯含量的RSD值分别为1.37%、4.28%、1.11%、1.14%、4.17%，均小于5.0%，说明供试品在15h内稳定性良好。

3.2.4 重复性实验 取川芎药材按供试品制备方法平行制备供试品6份，进样20μL，计算洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、3-正丁烯苯酞、阿魏酸、藁本内酯的含量，其RSD值分别为2.87%、2.89%、2.83%、1.75%、1.17%，均小于3.0%，说明方法重复性良好。

3.2.5 加样回收率实验 取已知含量的川芎药材6份，每份0.5 g，精密称定，分别加入阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯、3-正丁烯苯酞对照品各0.36 mg、0.54 mg、0.12 mg、0.27 mg和4.75 mg。按供试品溶液制备方法制备，每份进样20 μL，测定样品中含量，计算回收率。结果见表4，各指标成分的平均回收率为100.1%～104.2%。

表4 加样回收率实验(n=6)

0.12 0.12 108.3 3-正丁烯苯酞0.12 0.13 108.3 0.12 0.12 108.3 0.12 0.12 100.0 0.12 0.13 108.3 0.12 0.13 108.3 104.2 4.4 0.27 0.27 100.0阿魏酸0.27 0.26 96.3 0.27 0.28 103.7 0.27 0.29 107.4 0.27 0.30 111.1 0.27 0.28 103.7 103.7 5.05 4.75 4.79 100.8 4.75 4.69 98.7 4.75 4.75 100.0 4.75 4.79 100.8 4.75 4.75 100.0 4.75 4.75 100.0藁本内酯100.1 0.77

3.2.6 川芎药材中5种指标成分含量测定结果 按“2.3.3”项下方法制备不同批号的供试品溶液，精密吸取各供试品溶液20 μL，按上述色谱条件，平行测定3次，计算样品中5种指标成分的含量，含量测定结果见表2、图2。

图2 川芎药材高效液相色谱图

4 讨论

4.1 32批川芎药材中指标成分的含量测定结果表明，若仅以阿魏酸为标准，32批川芎药材均能满足2010年版药典中阿魏酸含量大于0.1%的规定。研究表明，洋川芎内酯A和Z-藁本内酯作为川芎的挥发油成分，具有活血通络，散风止痛等功效。所以单纯以阿魏酸作为含量测定指标不能全面有效地控制川芎的制剂质量。

4.2 从表1中可以看出，32批药材中5种指标成分的含量差异较大。其中藁本内酯的含量最高，阿魏酸和3-正丁烯苯酞的含量较低。从上海购买的川芎药材中藁本内酯的含量最大（79.34 mg/g），采自四川彭州的药材中洋川芎内酯I的含量最大（7.28 mg/g），来自吉林敖东的川芎饮片中3-正丁烯苯酞的含量最高（1.44mg/g），采自四川敖平的川芎饮片中洋川芎内酯A和阿魏酸的含量最高（分别为16.91 mg/g和2.54 mg/g），来自于新绿色药业的川芎药材中藁本内酯、洋川芎内酯A和阿魏酸的含量均为最低（分别为 9.78mg/g 、2.47mg/g 、0.63 mg/g）。综合以上考虑，建议以总平均含量的80%作为5种指标成分的质量标准（草案）含量标准测定项下。即藁本内酯、阿魏酸、3-正丁烯苯酞、洋川芎内酯A、洋川芎内酯I的最低限量分别为26.34 mg/g、1.152 mg/g、0.76 mg/g、4.53 mg/g、2.56 mg/g。

4.3 川芎常规理化测定结果表明，32批川芎药材中水分和醇浸出物含量结果均符合2010版药典规定的不高于12.0%（max 10.2%）和不低于12.0%（min 16.7%）的要求。32批药材中灰分含量测定范围在3.40%～7.94%，其中4批灰分含量超出了2010版药典规定的6.0%限度；酸不溶性灰分含量测定范围为0.17%～3.16%，其中两批未检测出酸不溶性灰分，两批药材的含量超出了药典规定的2.0%的限度。

4.4 实验中考察了提取方式（超声法、回流法）、提取溶剂（甲醇、无水乙醇、水）、溶剂浓度（30%、50%、90%）、溶剂用量（60、100、200倍）和提取时间（13、30、45min），最终确定以60倍溶剂用量、50%无水乙醇为提取溶剂、超声提取法、提取45min为最终提取条件。此条件操作简单，资源消耗最少，提取效率最高。

[1] Xiaozhen zhang,Hongbinxiao,Qing xu,et al.Characterization of phthalides in Ligusticum chuanxiong by Liquid chromatographic-Atmospheric Pressure Chemical Ionization-Mass Spectrometry[J].Journal of Chromatographic Science, 2003,41:428.

[2] 北京制药工业研究所.川芎有效成分的研究[J].药学学报,1979,11(11):670.

[3] 潘赞红,金鑫.川芎嗪与阿魏酸配伍对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌的保护作用[J].天津医药,2008,10(36):796.

[4] 高伟,梁日欣,肖永庆,等.川芎内酯A预处理对心肌微血管内皮细胞缺氧/复氧损伤保护作用及机制研究[J].中国中药杂志,2007,32(2):133.

[5] 忻志鸣,周晓明.川芎制剂的药理作用及临床应用[J].河北医药,1999,21(1):41.

[6] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010.

（责任编辑：蒋淼）

Systematic quality evaluation of Chuanxiong

GONG Ju-mei1,2,ZHANG Hui2, XIE Yuan-yuan2, CHEN Wei-dong1, WANG Yi-ming2, LUO Guo-an2//(1.Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031,Anhui; 2.Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084 ,China)

Objective:To systematically evaluate the quality of Chuanxiong produced in China.Method:The contents of 5 marker compounds in 32 samples of Chuanxiong were analyzed by HPLC method. The identifcation method of 5 marker compounds in Chuanxiong was developed by TLC. Some physical and chemical tests (H2O, total ash, acid insoluble ash and EtOH extract) were done to investigate their qualities.Result:5 marker compounds were found in 32 samples. There were signifcant differences in contents of the 5 marker compounds as well as physical and chemical parameters.Conclusion:The study provides theoretical and experimental data for the systematic quality evaluation of Chuanxiong in China.

Chuanxiong; quality evaluation; ferulic acid; ligustilide; senkyunolide; HPLC

R 284.1

A

1674-926X(2015)04-001-05

重大新药创制（2014ZX09304307001-010）中药新药安全性检测技术与标准研究

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031；2.清华大学化学系，北京 100084

龚菊梅（1988-），女，硕士在读，从事药剂学研究 Tel:13718053176 Email:gongjumei@163.com

谢媛媛（1980-），女，博士，高级工程师，研究方向：中药质量控制Tel:010-62772265 Email:yuanyuan8078@gmail.com

2014-12-01