高亚坤，林燕玲，段志莉，李晓坤，宋 昱，韩 梅

(河北医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河北 石家庄 050017)



·技术方法·

一种繁育Sm22α基因敲除纯合子小鼠的方法

高亚坤，林燕玲，段志莉，李晓坤，宋 昱，韩 梅*

(河北医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河北 石家庄 050017)

目的建立一种繁育平滑肌22alpha(smoothmuscle22alpha，Sm22α)基因敲除纯合子(Sm22α-/-)小鼠的方法。方法采用纯合子繁育方式即雄性纯合子与雌性纯合子交配，对有分娩征兆的孕鼠实施剖腹产手术，剖出的仔鼠由ICR雌鼠代乳。同时用传统的杂合子繁育方式即雄性纯合子与雌性杂合子交配作为对照，比较2种繁育方式产生的仔鼠断乳后存活率，并提取仔鼠尾基因组DNA，利用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术进行基因型鉴定。结果2种繁育方式受孕率及仔鼠断乳后成活率差异均无统计学意义(P>0.05)；子代纯合率基本符合孟德尔遗传规律。结论纯合子繁育方式不仅增加了纯合子的数量，且无需基因型鉴定，为Sm22α蛋白功能的研究提供了充足的实验动物模型。

小鼠,基因敲除；繁殖；纯合子doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.035

血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)是血管中膜的主要细胞成分，其表型转化、增殖与迁移是血管损伤性疾病如动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄等的共同病理生理学基础[1-2]。平滑肌22alpha(smoothmuscle22alpha，Sm22α)又称为转凝蛋白(transgelin)，是一种相对分子质量为22 000的actin结合蛋白，具有组织特异性，仅在平滑肌组织中特异性表达，广泛用于平滑肌细胞分化和表型转化的研究。该蛋白除了参与血管平滑肌细胞收缩和细胞骨架重构外，在血管平滑肌细胞增殖、血管炎症及氧化应激过程中也发挥重要作用[3-7]。因此，将Sm22α基因敲除(Sm22α-/-)小鼠应用于相应疾病模型的建立及细胞分子水平的研究，对深入理解人类相关疾病的发病机制，发现药物作用的新靶点，具有重要意义。Sm22α蛋白在子宫平滑肌细胞中，可能通过表达量的改变调控细胞内钙离子浓度，进而影响子宫平滑肌的收缩，是控制分娩发动的重要蛋白因子[8]。然而，在Sm22α-/-小鼠繁育过程中发现，有分娩征兆的Sm22α-/-孕鼠常因子宫收缩无力导致宫内窘迫，引起母、胎鼠死亡；而Sm22α+/-杂合子孕鼠产下的幼鼠中，Sm22α-/-纯合子鼠所占比例很低，可能与孕期过程中死亡有关。为了提高Sm22α-/-小鼠繁育成功率，本研究采用将雄性纯合子与雌性纯合子(Sm22α-/-♂×Sm22α-/-♀)交配，对妊娠期满，有分娩征兆的Sm22α-/-雌鼠行剖腹产手术，剖出的仔鼠由ICR雌鼠代乳，从而增加了Sm22α-/-纯合子小鼠子代的数量。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sm22α-/-小鼠，购自Jackson实验室，饲养于温度湿度恒定的独立通气笼盒系统中，标准鼠粮饲养，自由进食及饮水；ICR小鼠，3～6个月龄，购自山西医科大学实验动物中心。代乳鼠选择条件：已产过一胎，仔鼠成活率高，母性较好，有哺乳经验的ICR雌鼠。

本研究所涉及动物实验已经河北医学大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器与试剂 恒温加热板(Leica公司)；加热灯；手术器械(剪刀、镊子、止血钳)、纱布，经121 ℃高压灭菌35min；一次性手套、口罩、75%酒精。

1.2.2 Sm22α-/-小鼠交配及ICR代乳鼠制备 随机选则6～8周纯合子Sm22α-/-雄鼠10只及Sm22α-/-雌鼠20只，每天下午17:00按1∶2合笼、交配，第2天早晨8:00检查阴道栓；见栓时认为交配成功，并记录为受孕0.5d，分笼单独饲养；妊娠15d后每天认真观察是否有分娩征兆。交配时间为2周。根据推断法，在受孕第19.5d实施剖腹产手术。阴道栓出现假阴性时，可以根据触诊观察法判断分娩时间，即孕鼠下腹部膨大，阴道处于开口状态，用拇指和食指可以触摸到胎儿形状，当胎儿的头和腰部大小近似时进行剖腹产手术。ICR代乳雌鼠比Sm22α-/-小鼠提前1～3d与ICR雄鼠进行交配。同时，随机选择6～8周的杂合子Sm22α-/-雄鼠10只及Sm22α+/-雌鼠20只作为普通交配对照，按1∶2进行合笼、交配，持续2周；所有孕鼠均自然分娩和哺乳。

1.2.3 剖腹产手术 Sm22α-/-孕鼠经乙醚吸入麻醉,75%酒精消毒腹部皮肤，用手术剪剪开腹部皮肤和肌肉，充分暴露子宫，换一套洁净手术器械，立即打开子宫取出仔鼠，用无菌纱布迅速擦干仔鼠口鼻及身上的羊水、黏液及血迹，将仔鼠置于37℃的电热恒温板上，用手指轻拍其胸部辅助呼吸，直至仔鼠全身鲜红，能自由呼吸为止。剖腹产后Sm22α-/-母鼠，取其子宫组织，用于探究Sm22α影响子宫收缩的机制。

1.2.4 代乳 将代乳鼠的仔鼠全部弃掉或保留2～4只,取其笼内的垫料撒在 Sm22α-/-仔鼠身上，使其染味后放入代乳鼠笼内，约隔半小时后再观察其是否代乳。记录Sm22α-/-小鼠仔鼠断乳后存活情况，计算断乳后存活率。

1.2.5 Sm22α-/-小鼠基因型鉴定 提取子代小鼠尾基因组DNA进行基因型鉴定，引物序列如下：引物1为5′-GGCCCAGGGGTTGTCAAAATAGTC-3′；引物2为5′-CTCCTCCAGCTCCTCGTCATACTTC-3′；引物3为5′-CGCCGCATAACCAGTGAAACAG-3′。目的基因片段长度分别为：野生型(Sm22α+/+)480bp；纯合型(Sm22α-/-)750bp；杂合型(Sm22α+/-)480bp和750bp。PCR反应条件为：95 ℃ 2min，95 ℃ 30s、60 ℃ 45s、72 ℃ 1min(30个循环)，72 ℃ 5min。取PCR产物10μL用于1.0 %琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像观察结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件分析数据。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2种繁育方法受孕率及仔鼠成活率比较 所有小鼠的交配时间为2周。其中Sm22α-/-小鼠阴道栓检查阳性10只并实施剖腹产手术，共剖得仔鼠65只，全部用ICR小鼠代乳。普通交配方式中，12只杂合型Sm22α+/-小鼠受孕，自然分娩仔鼠70只。2种繁育方法的受孕率及仔鼠断乳后成活率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 2种繁育方法受孕率及仔鼠成活率比较 (只数，%)

2.2 仔鼠基因型鉴定结果 用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术对2种交配方式产生的子代小鼠进行基因型鉴定，纯合率分别为100.00%(51/57)和46.77 %(29/62)，与孟德尔遗传规律100%和50%的理论值相符。Sm22α+/-杂合型分别在750bp和480bp处可见清晰的PCR条带，Sm22α-/-纯合型在750bp处可见清晰的PCR条带，见图1

图1 仔鼠基因型鉴定结果

3 讨 论

基因敲除小鼠技术是借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法，将小鼠体内某种基因的功能缺失，以揭示该基因的功能[9]。Sm22α是血管平滑肌细胞骨架重构的调节蛋白，其表达水平的变化与血管平滑肌细胞的表型重塑和血管疾病密切相关。近年来研究者利用Sm22α-/-小鼠建立了多种人类相关疾病模型[6-7,10]，对Sm22α在相关病理过程及疾病中的作用及机制有了新的认识。因此，建立一种繁育Sm22α-/-小鼠的新方法，增加Sm22α-/-小鼠子代的数量，有助于进一步满足相关疾病研究的需要。此外，该方法中，剖腹产后的Sm22α-/-母鼠，可以用于研究Sm22α对子宫收缩机制的影响。

基因敲除小鼠通常的繁育方式为雄性纯合子与雌性杂合子交配，产生的子代经PCR基因鉴定后，纯合子小鼠可用于实验研究。但这种交配方式产生纯合子的概率只有50%(实际的纯合子出生率更低)，无法满足大量研究需求。而采用纯合子交配方式，即雄性纯合子×雌性纯合子(Sm22α-/-♂×Sm22α-/-♀)交配，剖腹产手术剖出子代，并由ICR雌鼠代乳，存活的子代全部为纯合子，其子代的断乳后存活率与杂合子交配方式差异无统计学意义。缺点是需要每天人工交配，检查阴道栓，并实施剖腹产手术，一定程度上增加了工作量。

在小鼠剖腹产手术操作过程中，需要注意以下几点：①剖腹产手术确保无菌操作，所有实验用手术器械及纱布均要高压灭菌，实验台及恒温加热板均用75%乙醇消毒；②注意保温，手术操作全程在37 ℃左右的环境下进行，剖出的仔鼠置于37 ℃电热恒温加热板上，防止温度过低导致其死亡；③手术操作过程要迅速，快速处死待剖腹产雌鼠，快速取出子宫，快速剥离胎儿，并迅速将其口鼻及身上黏液等物质反复擦干净，使其自由呼吸；④染味时间要足够，用代乳鼠笼内垫料或尿液染味2～3min，防止代乳鼠吃仔鼠现象；⑤不要过早更换代乳鼠笼内垫料，代乳1周后可更换垫料，以免造成环境改变，引起代乳鼠应激反应。此外，要准确计算小鼠妊娠期，提前进行剖宫产，可能部分仔鼠尚未发育成熟，影响其存活率，推迟行剖腹产，可能造成母鼠宫内窘迫，引起母鼠及仔鼠的死亡。

本研究首次选用经产的ICR母鼠进行代乳，主要是因其性情温顺，几乎没有吃仔鼠行为，在小鼠剖腹产代乳研究中较多应用[11]。同时，由于ICR小鼠与Sm22α-/-小鼠的体型、毛色等基本性状截然不同，所以不会造成遗传污染。此外，在代乳过程中将代乳鼠的仔鼠保留2～4只，是为了繁育ICR小鼠，以满足代乳需要，而对Sm22α-/-仔鼠的成活率没有影响。研究发现ICR代乳鼠一次代乳6～7只仔鼠时，仔鼠成活率最高，所以当Sm22α-/-产仔较多时，将ICR仔鼠全部弃掉。弃掉的仔鼠全部人工喂养，避免了实验动物的浪费。

本实验结果显示，2种交配方式产生的子代小鼠断乳后存活率差异无统计学意义，而纯合子交配方式产生的纯合子数量大，无需进行基因型鉴定，能更好地满足基础研究的需求。

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(本文编辑：赵丽洁)

2015-09-07；

2015-10-22

国家自然科学基金课题(31271222；31471092)

高亚坤(1987-)，女，河北沧州人，河北医科大学基础医学院医学硕士研究生，从事血管生物学研究。

*通讯作者。E-mail：hanmei@hebmu.edu.cn

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1007-3205(2015)11-1356-03