宋 晓，席 强，王 刚

(1.河北北方学院附属第一医院放疗科，河北 张家口 075000；2.四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心，四川 成都 610064)



·论 著·

肺腺癌转移机制的研究与探讨

宋 晓1，席 强1，王 刚2

(1.河北北方学院附属第一医院放疗科，河北 张家口 075000；2.四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心，四川 成都 610064)

目的筛选转移性肺腺癌组织与相应正常组织之间的差异基因表达图谱。方法利用现代高通量表达谱芯片技术比较4对转移性肺腺癌组织与其相应正常组织之间的差异基因表达图谱。通过文献挖掘和生物信息学方法分析显著性差异表达基因的功能。结果与正常组织比较，在转移性肺腺癌组织中发现了46个显著性差异表达基因，其中包括24个高表达的差异基因(USP33、FOXC1和PPBP等)和22个低表达的差异基因(SPATA13、SBF1和TFIP11等)。生物信息学分析表明，这些基因在肿瘤的发生和转移过程中发挥着重要的作用。结论基因表达图谱的改变与肿瘤的发生和转移密切相关。

肺肿瘤；肿瘤转移;基因表达谱doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.026

21世纪，肺癌在世界范围内是癌症相关死亡的主要原因之一，5年生存率仅为5%～8%[1-2]。转移是癌症最主要的恶性标志和特征之一，也是导致癌症治疗失败和癌症患者死亡的最主要原因，80%～90%肺癌患者死亡是由转移引起的[3-5]。转移形成最关键的异常通路包括酪氨酸激酶受体、上皮-间质细胞转型、肿瘤血管形成等[6]。但是，对于肿瘤细胞转移过程中的很多机制还知之甚少。本研究利用全基因组表达谱芯片技术，筛选转移性肺腺癌患者的癌组织与相应正常组织之间的差异基因表达图谱，旨在为肿瘤转移的临床诊断和治疗提供理论依据和支撑。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年1—12月河北北方学院附属第一医院转移性肺腺癌患者4例的癌组织样本和相应正常组织样本。所有患者的组织样本都经过病理科2位资深病理专家的诊断，保证组织样本病理资料的可靠性与取材样本的准确性。在样本取材之前，患者以及家属均签署知情同意书，并经过医院医学伦理委员会的同意。临床患者信息见表1。

表1 患者临床信息

1.2RNA抽提和纯化 采用RNeasyMiniKit(QIAGEN)并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的总RNA抽提，抽提所得总RNA经安捷伦2100生物分析仪电泳质检合格后备用。

1.3 样品RNA的放大和标记 样本RNA采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒，单色标记试剂盒和标准操作流程对样品总RNA中的mRNA进行放大和标记，并用RNeasyMiniTit(QIAGEN)纯化标记后的cRNA。

1.4 芯片杂交 按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，在滚动杂交炉中65 ℃，10r/min，滚动杂交17h，杂交cRNA上样量1.65μg，并在洗缸(ThermoFisher)中洗片，洗片所用的试剂为基因表达谱芯片洗脱缓冲液试剂盒。

1.5 芯片扫描 完成杂交的芯片采用安捷伦芯片扫描仪进行扫描，用FeatureExtractionSoftware10.7读取数据，最后采用GeneSpringSoftware11.0进行归一化处理，所用的算法为Quantile。

1.6 差异基因筛选 用基因芯片显著性分析(SignificantAnalysisofMicroarray，SAM)方法筛选具有差异表达的基因。

1.7 生物信息学分析

1.7.1 基因本体论(geneontology,GO)分析 通过TheGeneOntology数据库，GO分析可以分析差异表达基因的主要功能。Fisher检验和χ2检验来区分和选择显著性的GO亚类，GO校验计算返回的富集度P值表明GO功能是否具有显著性。

1.7.2Pathway(通路)分析 利用KEGG、Biocarta等数据库，通路分析可以发现差异表达基因的显著性通路。Fisher检验和χ2检验用来选择显著性的通路，P值和误判率(falsediscoveryrate，FDR)值用来定义显著性的阈值。

1.8 统计学方法 应用SPSS18.0统计学软件进行数据分析,计数资料比较采用Fisher检验和χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 转移性肺腺癌组织与相应正常组织之间的差异基因表达图谱 为了研究转移性肺腺癌组织与相应正常组织之间的差异基因表达图谱，筛选出肺腺癌转移相关基因，了解肺腺癌转移的相关机制，本研究利用Agilent人类基因表达谱芯片(AgilentWholeHumanGenomeOligoMicroarray，4*44K)区分了转移性肺腺癌组织与相应正常组织之间的全基因组表达图谱。严格按照Agilent表达谱芯片的质控标准，以基因表达量改变倍数>2和P<0.05为筛选标准，选出的差异mRNA作为候选基因。在二维基因聚类图谱中，每一列代表了样本，每一行代表了探针ID(基因)，颜色的深浅代表了每一个基因在不同样本中的相对表达量。同时，从聚类图谱中可以发现样本的分组情况比较好(图1)。

2.2 46个候选的差异基因的表达情况 按照上述严格的数据处理和筛选标准，与正常组织相比，在转移性肺腺癌组织中，共发现了46个显著性的差异表达基因，其中24个差异基因是高表达的，22个差异基因是低表达的。在24个上调的差异表达基因中，泛素特异性肽酶33(ubiquitinspecificpeptidase33，USP33)是上调倍数最多的基因(基因表达变化倍数=13.48，P=0.000 01)。在22个下调的差异表达基因中，釉丛蛋白星湖作用蛋白11(tuftelininteractingprotein11，TFIP11)是下调倍数最多的基因(基因表达变化倍数=7.93，P=0.000 18)。见表2。

表2 46个候选差异基因的表达情况

表2 (续)

2.3 文献挖掘 通过文献挖掘，发现在上述46个显著性差异表达基因中，一些基因已经被报道和研究过与肿瘤的转移和发生有关，特别是叉头框蛋白C1(forkheadboxC1,FOXC1)、小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(FBJmurineosteosarcomaviraloncogenehomolog，FOS)、视神经萎缩基因1(opticatrophy1，OPA1)、zincfingerandBTBdomaincontaining7A(ZBTB7A)、Thetuberoussclerosis-1(TSC1)这几个基因，它们的表达与功能在很多肿瘤的转移和发生过程中发挥着重要的作用。

2.4 生物信息学分析 为了更好地理解和发现这些显著性差异表达基因在肿瘤的发生和转移过程中的作用，本研究利用生物信息学方法对这些基因进行了GO和Pathway的深入分析。利用TheGeneOntology数据库，发现这些显著性差异表达基因主要影响了16条GO功能(图2)，其中影响最显著的GO为细胞凋亡，还有转座酶活性等。利用KEGG等数据库进行通路分析，发现了20条显著性通路(图3)，其中最显著的信号通路是IL-6信号通路(IL-6signalingpathway)，还有NK细胞介导细胞毒性的Ras信号通路(Ras-IndependentpathwayinNKcell-mediatedcytotoxicity)等。

3 讨 论

本研究利用现代高通量人类表达谱芯片技术[7-8]，比较了转移性肺腺癌患者的癌组织与相应正常组织之间的全基因组表达图谱。按照表达谱芯片的严格质控标准，以差异倍数>2和P<0.05为筛选标准，在转移性肺腺癌与相应正常组织之间共筛选出了46个显著性的差异表达基因。与正常组织相比，在转移性肺腺癌组织中有24个差异基因是上调表达的，22个差异基因是下调表达的。在24个上调的显著性差异表达基因中，USP33是上调倍数最多的基因；而在22个下调基因中，TFIP11是下调倍数最多的基因。这些显著性差异表达基因可能在肺腺癌的发生和转移过程中发挥着重要的作用。

通过文献挖掘分析，发现上述46个显著性差异表达基因，其中一些基因已经被发现和研究过与肿瘤的发生和转移密切相关。研究发现USP33的表达水平是Slit信号抑制结肠癌细胞迁移的一个重要因素[9]。叉头框蛋白1(forkheadboxC1，FOXC1)也是上调倍数比较明显的基因，已有相当多的文献报道它与癌症的发生和转移相关。FOXC1的高表达发生在胰腺导管癌、非小细胞癌、肝癌、乳腺癌等，它的表达与这些肿瘤的发生和预后密切相关[10-12]。同时，FOXC1的高表达可以通过诱导上皮间充质转换发生和上调神经前体细胞表达、发育调控蛋白9基因(neuralprecursorcellexpressed,developmentallydown-regulated9，NEDD9)的表达来促进肝细胞癌的转移[12-13]。另外，FOXC1也可以通过诱导基质金属蛋白酶7(matrixmetalloproteinase7，MMP7)的表达来促进乳腺癌的侵袭能力[14],FOXC1的过表达在非小细胞肺癌的转移和发生中有重要作用，可以作为非小细胞肺癌治疗和预后的一个标志物[15]。视神经萎缩蛋白1(opticatrophy1,OPA1)在肺腺癌中是高表达的，可以预示肺腺癌的预后较差；OPA1突变也在很多疾病中发挥着重要作用[16-17]。ZBTB7A(又称作LRF、ZBTB7或pokemon等)在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌中都是过表达的，它的过表达可以增加肿瘤的恶性程度和耐药性[18-20]。在转移性腺癌组织中低表达的22个显著性差异表达基因中，SPATA13(Spermatogenesis-associatedprotein13，又名Asef2)可以通过调控Rho-familyGTPases的活性来促进癌细胞的迁移和快速粘连运输[21]，同时Asef2在结肠癌细胞的转移过程中发挥重要作用[22]。SIRT3在肝细胞癌中是低表达的，作为一个肿瘤抑制因子，它可以通过影响肝癌细胞的增殖和入侵从而发挥重要作用[23]；过表达SIRT3可以抑制乳腺癌细胞的糖酵解过程和细胞增殖过程，为抑制肿瘤的发生提供了一种代谢机制[24]。除了上述描述的基因外，在转移性腺癌组织中高表达的基因E2F6(E2Ftranscriptionfactor6)、ACRBP(acrosinbindingprotein)、ARL6IP1(ADP-ribosylationfactor-likeprotein6-interactingprotein1)，低表达的基因TSC1、PKNOX1(PBX/knotted1homeobox1)等基因与肿瘤的发生和转移有关。

为了更加深入地了解这些显著性差异表达基因在肿瘤的发生和转移过程中发挥的重要作用，本研究利用生物信息学方法对这些基因进行了GO和Pathway分析。通过TheGeneOntology数据库分析，发现了16条显著性GO，其中包括细胞凋亡、转座酶活性等。通过KEGG数据库进行Pathway分析，筛选出20条显著性Pathway，包括IL-6信号通路(IL-6signalingpathway)、自然杀伤细胞介导细胞毒性的Ras信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路等。其中一些重要的通路，如Ras通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路在肿瘤的发生和转移过程中都发挥着重要的作用[25-27]。

本研究结果表明，在肺腺癌的发生和转移过程中，基因表达图谱会发生很多变化，尤其是一些与肿瘤发生和转移密切相关的基因。通过区分转移性肺腺癌组织与正常组织之间的全基因组表达谱，可以为临床治疗提供参考数据。总之，利用基因表达谱来区分、预测、治疗肺腺癌可能会成为未来临床应用的一个很好的工具。(本文图见封三)

[1]deSantisCE,LinCC,MariottoAB,etal.Cancertreatmentandsurvivorshipstatistics,2014[J].CACancerJClin，2014,64(4):252-271.

[2]RidgeCA,McErleanAM,GinsbergMS.Epidemiologyoflungcancer[J].SeminInterventRadiol，2013,30(2):93-98.

[3]WanL,PantelK,KangY.Tumormetastasis:movingnewbiologicalinsightsintotheclinic[J].NatMed，2013,19(11):1450-1464.

[4]ChenQ,MassaguéJ.Molecularpathways:VCAM-1asapotentialtherapeutictargetinmetastasis[J].ClinCancerRes，2012,18(20):5520-5525.

[5]WellsA,GrahovacJ,WheelerS,etal.Targetingtumorcellmotilityasastrategyagainstinvasionandmetastasis[J].TrendsPharmacolSci，2013,34(5):283-289.

[6]CreightonCJ,GibbonsDL,KurieJM.Theroleofepithelial-mesenchymaltransitionprogrammingininvasionandmetastasis:aclinicalperspective[J].CancerManagRes，2013,5:187-195.

[7]HouR,YangZ,LiM,etal.Impactofthenext-generationsequencingdatadepthonvariousbiologicalresultinferences[J].SciChinaLifeSci,2013,56(2):104-109.

[8]GorretaF,CarboneW,BarzaghiD.Genomicprofiling:cDNAarraysandoligoarrays[J].MethodsMolBiol，2012,823:89-105.

[9]HuangZ,WenP,KongR,etal.USP33mediatesSlit-Robosignalingininhibitingcolorectalcancercellmigration[J].IntJCancer，2015,136(8):1792-1802.

[10]WangL,GuF,LiuCY,etal.HighlevelofFOXC1expressionisassociatedwithpoorprognosisinpancreaticductaladenocarcinoma[J].TumourBiol，2013,34(2):853-858.

[11]WeiLX,ZhouRS,XuHF,etal.HighexpressionofFOXC1isassociatedwithpoorclinicaloutcomeinnon-smallcelllungcancerpatients[J].TumourBiol,2013,34(2):941-946.

[12]XiaL,HuangW,TianD,etal.OverexpressionofforkheadboxC1promotestumormetastasisandindicatespoorprognosisinhepatocellularcarcinoma[J].Hepatology,2013,57(2):610-624.

[13]XuZY,DingSM,ZhouL,etal.FOXC1contributestomicrovascularinvasioninprimaryhepatocellularcarcinomaviaregulatingepithelial-mesenchymaltransition[J].IntJBiolSci,2012,8(8):1130-1141.

[14]SizemoreST,KeriRA.TheforkheadboxtranscriptionfactorFOXC1promotesbreastcancerinvasionbyinducingmatrixmetalloprotease7(MMP7)expression[J].JBiolChem,2012,287(29):24631-24640.

[15]WangG,LunardiA,ZhangJ,etal.Zbtb7asuppressesprostatecancerthroughrepressionofaSox9-dependentpathwayforcellularsenescencebypassandtumorinvasion[J].NatGenet，2013,45(7):739-746.

[16]FangHY,ChenCY,ChiouSH,etal.Overexpressionofopticatrophy1proteinincreasescisplatinresistanceviainactivationofcaspase-dependentapoptosisinlungadenocarcinomacells[J].HumPathol,2012,43(1):105-114.

[17]Yu-Wai-ManP,ChinneryPF.Dominantopticatrophy:novelOPA1mutationsandrevisedprevalenceestimates[J].Ophthalmology,2013,120(8):1712.

[18]KimK,ChadalapakaG,LeeSO,etal.IdentificationofoncogenicmicroRNA-17-92/ZBTB4/specificityproteinaxisinbreastcancer[J].Oncogene，2012,31(8):1034-1044.

[19]LunardiA,GuarnerioJ,WangG,etal.RoleofLRF/Pokemoninlineagefatedecisions[J].Blood，2013,121(15):2845-2853.

[20]YangX,ZuX,TangJ,etal.Zbtb7suppressestheexpressionofCDK2andE2F4inlivercancercells:implicationsfortheroleofZbtb7incellcycleregulation[J].MolMedRep，2012,5(6):1475-1480.

[21]JeanL,MajumdarD,ShiM,etal.ActivationofRacbyAsef2promotesmyosinⅡ-dependentcontractilitytoinhibitcellmigrationontypeⅠcollagen[J].JCellSci，2013,126(Pt24):5585-5597.

[22]LeveF,Morgado-DíazJA.RhoGTPasesignalinginthedevelopmentofcolorectalcancer[J].JCellBiochem，2012,113(8):2549-2559.

[23]ZhangB,QinL,ZhouCJ,etal.SIRT3expressioninhepatocellularcarcinomaanditsimpactonproliferationandinvasionofhepatomacells[J].AsianPacJTropMed,2013,6(8):649-652.

[24]HaigisMC,DengCX,FinleyLW,etal.SIRT3isamitochondrialtumorsuppressor:ascientifictalethatconnectsaberrantcellularROS,theWarburgeffect,andcarcinogenesis[J].CancerRes,2012,72(10):2468-2472.

[25]WardAF,BraunBS,ShannonKM.TargetingoncogenicRassignalinginhematologicmalignancies[J].Blood，2012,20(17):3397-3406.

[26]SantarpiaL,LippmanSM,El-NaggarAK.TargetingtheMAPK-RAS-RAFsignalingpathwayincancertherapy[J].ExpertOpinTherTargets，2012,16(1):103-119.

[27]YangSH,SharrocksAD,WhitmarshAJ.MAPkinasesignallingcascadesandtranscriptionalregulation[J].Gene，2013,513(1):1-13.

(本文编辑：赵丽洁)

2015-04-01；

2015-06-30

国家自然科学基金资助项目(31370972)

宋晓(1975-)，男，山东乳山人，河北北方学院附属第一医院主治医师，医学硕士，从事肿瘤放射治疗研究。

R

B

1007-3205(2015)11-1332-06