孙　坤,张宏涛,陈　纹,李小伟,苏　雪

(西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州　730070)

干旱胁迫对肋果沙棘(Hippophaeneurocarpa)试管苗叶片黄酮类化合物代谢的影响

孙坤,张宏涛,陈纹,李小伟,苏雪

(西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州730070)

摘要：为了探讨干旱胁迫对沙棘叶片黄酮类化合物代谢的影响，以肋果沙棘试管苗为材料，研究了不同浓度PEG-6000(0%,10%,20%,30%)对叶片类黄酮积累及其合成过程中相关酶PAL、C4H和4CL活性的影响.结果显示：(1)随干旱胁迫程度的增强，总黄酮、槲皮素、山奈酚和杨梅素含量均表现为先下降后上升的趋势，20% PEG-6000胁迫下其含量最低，比对照分别下降了20.36%,12.84%,47.81%,63.22%；在不同浓度PEG-6000胁迫下异鼠李素含量与对照相比均有升高，10% PEG-6000胁迫下其含量最高，比对照升高了79.99%.(2)干旱胁迫显著影响肋果沙棘试管苗叶片PAL、C4H和4CL的活性(P<0.05).随着胁迫程度的增加，PAL活性显著升高；C4H和4CL活性呈先升高后降低的趋势，在20% PEG-6000胁迫下达到最高.(3)杨梅素、槲皮素、山奈酚及总黄酮含量均与PAL、C4H和4CL活性负相关.尽管干旱胁迫促进了相关酶的活性，但肋果沙棘试管苗叶片中总黄酮含量并没有显著变化.

关键词：肋果沙棘；PEG-6000；干旱胁迫；黄酮类化合物；PAL；C4H；4CL

中图分类号：Q 945.78

文献标志码：A

文章编号：1001-988Ⅹ(2015)03-0072-07

Effects of drought stress on flavonoids metabolism involved

in test-tube plantlets leaves ofHippophaeneurocarpa

SUN Kun,ZHANG Hong-tao,CHEN Wen,LI Xiao-wei,SU Xue

(College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu，China)

Abstract:Taking test-tube plantlets of Hippophae neurocarpa as materials，the current study is carried out to investigate the effect of drought stress on the flavonoids accumulation and activities of Enzymes．There are four drought levels：the control(without adding PEG-6000)，10% PEG-6000，20% PEG-6000，30% PEG-6000．The result show that：(1)With the serious of drought stress，the contents of quercetin，kaempferol，myricetin and total flavonoids contents decreased at first，and then increased，which reachs the lowest value under 20% PEG-6000,and the values are 20.36%，12.84%，47.81%，63.22% lower than that of control,respectively．The content of isorhamnetin is increased under PEG-6000 stress compared with control，and it reachs the highest value under 10% PEG-6000,and the value is 79.99% higher than that of control;(2)A significant difference for PAL，C4H and 4CL is found in test-tube plantlets leaves of H.neurocarpa under the drought stress(P<0.05)．With the serious of drought stress，the activity of PAL is significantly increased．The activity of C4H and 4CL increased at first，and then decreased，which reachs the highest value under 20% PEG-6000;(3)Linear regression analysis shows that the contents of kaempferol，myricetin，the total flavonoids and the activities of PAL，C4H，4CL present negative correlation．Although the related enzyme activities are increased by drought stress，the contents of total flavonoids in test-tube plantlets leaves of H.neurocarpa is not significantly changed．

Key words:Hippophae neurocarpa；PEG-6000；drought stress；flavonoids；PAL；C4H；4CL

黄酮类化合物又名生物类黄酮，是一种广泛分布于植物体内的次生代谢产物，是现代医药、食品等工业的重要原料，且在植物自我保护及适应环境方面起重要作用[1].对大多数植物而言，类黄酮等次生代谢产物的合成往往受到所处环境的影响，并且以此决定其次生代谢产物合成的种类及数量[2]，往往表现为环境越恶劣其次生代谢物含量就越高[3].在众多的环境因素中，干旱胁迫是影响植物次生代谢的最重要因子之一[4].目前，干旱胁迫对植物叶片黄酮类化合物含量的影响已有较多研究，但结果不尽相同[1,5-10].有研究表明银杏、女贞和酸枣在干旱胁迫下叶片中类黄酮合成与积累没有明显变化[1,5,9,10]，而朱灿灿等研究表明，适度干旱胁迫有利于叶片黄酮类物质的合成[8].类黄酮等次生代谢产物的生物合成与积累又受苯丙烷代谢途径的调控[11]，其中，苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase,PAL),内桂酸4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)，4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶[11-13]，可有效调节与之相应的植物次生代谢产物的合成与积累[14-18].圆柏属植物叶片黄酮类化合物含量随PAL活性升高而增加，证实了PAL在其黄酮类化合物合成中具有重要作用[19].但也有研究认为银杏叶片黄酮类化合物含量随PAL、C4H和4CL活性升高而降低[18]，木质素含量随PAL、C4H和4CL活性升高而增加[20,21].因此，PAL、C4H和4CL对黄酮类化合物积累的影响因不同植物而异.

沙棘属(HippophaeL)植物各器官均富含黄酮类等多种天然化学成分，具有重要的生态效益和社会效益[22],其黄酮类化合物的研究主要集中在优化提取工艺、医药研究和不同器官及种间的含量差异等方面[23-26].肋果沙棘(Hippophaeneurocarpa)为沙棘属中一个仅生长在青藏高原高海拔地区的类群，然而，干旱胁迫对肋果沙棘黄酮类化合物的积累及其合成代谢相关酶活性变化有怎样的影响呢？本研究通过PEG-6000溶液模拟干旱胁迫，探究该胁迫对肋果沙棘试管苗叶片黄酮类化合物积累以及PAL,C4H和4CL活性变化的影响，探讨其黄酮类化合物积累与苯丙烷代谢关键酶PAL,C4H和4CL的关系，同时为深入认识肋果沙棘与环境的相互关系提供依据.

1材料与方法

1.1试管苗的培养

将肋果沙棘种子去皮后用70%的酒精浸泡2 min，2%的次氯酸钠消毒30 min，无菌水冲洗5次后放在培养皿中，并置于光照培养箱(20 ℃、光周期12 h、光强2 000 lx)中培养.7 d后根长2 cm左右时接种于MS+0.5 mg·L-16-BA培养基中诱导丛生芽，继代培养接种于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IAA+30 g·L-1蔗糖+7.8 g·L-1琼脂，pH 5.8，150 mL广口三角瓶中进行试管苗丛生芽增殖培养，每隔15 d左右继代1次，继代3～4次后，将试管苗转接于不含任何激素的MS培养基中，用于实验.

1.2试剂与仪器

对照品杨梅素(批号 529-44-2)、槲皮素(批号117-39-5)、山奈素(批号520-18-3)和异鼠李素(批号480-19-3)均购自西亚试剂公司；色谱纯甲醇、双蒸水，其余所用试剂均为分析纯；高效液相色谱仪(Agilent 1100，USA)，RE52AA型旋转蒸发器(北京成萌伟业科技有限公司)，AR-2140 型分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，DH-120DTN型超声清洗器(上海狄昊实业发展有限公司)，高速冷冻离心机(Beckman，TGL-16M，USA)，岛津紫外分光光度计(UV1800，Japan).

1.3实验方法及测定指标

选择大小一致、长势旺盛的幼芽接种于150 mL广口三角瓶中，采用固液培养法进行干旱胁迫处理.5 d后收集分别用0%(CK),10%(10 g·kg-1),20%(20 g·kg-1),30%(30 g·kg-1)浓度PEG-6000处理的试管苗叶片用于PAL,C4H,4CL活性和类黄酮化合物含量的测定.所有试验均重复三次.

1.3.1PAL,C4H和4CL活性

1)PAL活性的测定.PAL活性测定参照陈雷[18]等的方法.称取肋果沙棘叶片0.2 g，加入少许石英砂研碎，加入0.1 mol·L-1pH 8.8硼酸缓冲液(10%甘油、巯基乙醇5 mmol·L-1,1 mmol·L-1EDTA)2 mL，在冰浴中研磨匀浆，匀浆于4 ℃ 下12 000 r·min-1离心20 min，取上清液用于酶活力检测.反应液包括上清液0.1 mL，3 mL 0.02 mol·L-1苯丙氨酸缓冲液，对照不加苯丙氨酸缓冲液.混匀后于45 ℃恒水浴中反应30 min，加入6 mol·L-1盐酸0.5 mL溶液终止反应.在290 nm处测定吸光度OD值.以每小时每毫升酶液在290 nm处吸光度变化0.1 OD所需的酶量为一个酶活单位U(相当于1 mL反应混合物形成1 μg肉桂酸).

2)C4H活性的测定.C4H活性测定按照陈雷[18]等的方法.称取试管苗叶片0.2 g，加入5 mL 4 ℃下预冷的pH 7.6的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(含0.5 mmol·L-1EDTA,0.25 mol·L-1蔗糖、2 mmol·L-1巯基乙醇)，冰浴下研磨匀浆，4 ℃下12 000 r·min-1离心30 min，上清液用于酶活性检测.测定系统含有酶液0.2 mL,4.0 mg·mL-1NADPH 3 mL,50 mmol·L-1肉桂酸0.2 mL,0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.6)3 mL.对照不加酶液，用磷酸缓冲液代替.反应液在30 ℃保温30 min，加入6 mol·L-1盐酸0.2 mL终止反应，取上清液用NaOH调pH=11，340 nm下测定吸光度，以每分钟OD值变化0.01为一个酶活单位U.

3)4CL活性的测定.4CL活性测定按照陈雷[18]等的方法.称取0.5 g试管苗叶片，加液氮迅速磨成粉末，放入预冷的0.2 mol·L-1pH 8.0的Tris-HCl缓冲液5 mL(含15 mmol·L-1的巯基乙醇及10%的甘油)，充分混合，4 ℃ 10 000 r·min-1离心20 min，上清液用于酶活性测定.反应体系包括：3 mL 0.1 mol·L-1pH 8.0的Tris-HCl缓冲液(含5 mmol·L-1ATP，0.2 mmol·L-1对香豆酸，5 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.3 mmol·L-1CoA)，加入150 μL粗酶液开始反应.对照不加CoA.40 ℃反应10 min后，加入6 mol·L-1盐酸0.5 mL终止反应，在333 nm处测定OD值.OD值每分钟变化0.01为一个酶活性单位U.

1.3.2黄酮类化合物含量

1)检测波长的确定与专属性试验.配制槲皮素、山奈酚、异鼠李素、杨梅素对照品溶液，以甲醇为空白，在200～500 nm的范围内做紫外扫描，结果显示：槲皮素、山奈酚和异鼠李素、杨梅素在甲醇中的最大吸收波长分别为370 nm,364 nm,369.5 nm和 375 nm，因此选择370 nm作为检测波长.

2)供试样品溶液的制备.将肋果沙棘试管苗叶片烘干、磨细，并且过100目筛，石油醚过夜除脂.干燥后精确称取样品0.50 g，加入75%的乙醇，功率100 KHZ，70 ℃水浴，液料比为1∶30的条件下超声回流30 min，重复三次，合并滤液并浓缩滤液至约15 mL.按1∶2精密量取滤液与2 mol·L-1盐酸，在95 ℃条件下加热回流45 min后冰浴，冷却后加入Isoamylalkohol(IAA，异戊醇)11.25 mL萃取，吸取上相液体(含有水解的黄酮类物质)，甲醇定容于50 mL的容量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液.

3)标准曲线的制作.精确称取10 mg槲皮素、2.5 mg山奈素、10 mg异鼠李素和10 mg杨梅素对照品于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分别配制0.2 mg·mL-1,0.05 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1和0.02 mg·mL-1的对照品溶液,并稀释为不同浓度梯度溶液.进样量10 μL，这4种黄酮苷元杨梅素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素均呈良好的线性关系(表1).线性关系中,y为色谱峰面积，x为对照品浓度(μg·mL-1)

表1　4种对照品的线性关系

1.4数据统计与分析

数据统计分析和图表由Microsoft Excel 2003,SPSS 21.0,CoreDraw 9.0和Origin Pro 7.5软件系统完成BFQ，用Duncan多重比较法进行差异显著性检验，用Pearson法进行相关性分析，检验显著性水平为0.05.

2结果与分析

2.1干旱胁迫对肋果沙棘试管苗叶片黄酮类化合物组成及含量的影响

肋果沙棘试管苗叶片总黄酮含量随干旱胁迫程度的增强主要表现为先下降后上升的趋势(图1A).槲皮素、山奈酚和杨梅素含量的变化与总黄酮类似，均表现为先下降后上升的趋势(图1B,C,D)，且在20% PEG-6000胁迫下其含量最低，与对照相比，总黄酮、槲皮素、山奈酚、杨梅素含量分别下降了20.36%,12.84%,47.81%,63.22%.与对照相比，10%,20%和30%的PEG-6000胁迫下异鼠李素含量均有所升高(图1E)，其含量分别增加了79.99%,2.82%,42.52%，说明干旱胁迫有利于异鼠李素含量的积累.

肋果沙棘试管苗叶片槲皮素含量最高，其次是山奈酚.对照组中，杨梅素含量高于异鼠李素，而在不同浓度的PEG-6000胁迫下表现为异鼠李素含量高于杨梅素.说明干旱胁迫不利于杨梅素含量的积累，但能促进异鼠李素含量增加.

2.2干旱胁迫对肋果沙棘试管苗叶片PAL,C4H,和4CL活性的影响

干旱胁迫显著影响肋果沙棘试管苗叶片PAL,C4H和4CL活性(P<0.05)，不同酶的活性变化存在一定差异.PAL活性随胁迫程度的增强而升高，在30%的PEG-6000胁迫下其活性最高，比对照升高了66.68%(图2A)；C4H和4CL活性随胁迫程度的增强均呈先升高后下降的趋势，20%的PEG-6000胁迫下其活性最高，比对照分别升高了49.46%,110.42%.但在30% PEG-6000胁迫下，C4H活性与对照差异不显著(图2B)，而4CL活性比对照显著增加了62.64%(图2C).

以上结果说明，肋果沙棘试管苗叶片PAL、C4H和4CL对干旱胁迫较为敏感.干旱胁迫下，肋果沙棘试管苗加强了苯丙烷类代谢途径，提高了三个关键酶的活性.

2.3回归分析

回归分析表明，杨梅素、槲皮素、山奈酚及总黄酮含量均与PAL,C4H和4CL活性呈负相关关系，主要表现为杨梅素含量与PAL活性呈显著负相关关系，山奈酚和杨梅素含量均与4CL活性呈极显著负相关关系，总黄酮含量与4CL活性呈显著负相关关系(表2).

图中不同字母表示各处理差异显著性(P<0.05)，下同

Different letters indicate significant differences among treatmentsP<0.05;The same as below.

图1干旱胁迫对肋果沙棘试管苗黄酮类化合物含量的影响

Fig 1Effect of drought stress on the contents of flavonoids

in test-tube plantlets leaves ofH.neurocarpa

图2　干旱胁迫对肋果沙棘试管苗PAL,

3讨论

植物在适应环境胁迫过程中，通过产生数目庞大的次生代谢产物，形成对逆境胁迫的一种特殊响应.实验室常以试管苗为试材模拟环境胁迫[27,28]，其遗传基础具有同质化特征、便于管理和控制实验条件等优点，并且能较好地避免野外取样的生长年限、生育期和生长状态不一致的影响.有研究发现多数植物在干旱、伤害、紫外辐射等逆境胁迫下，防卫系统尤其是苯丙烷类代谢被激活，催化体内多种具有防御功能的次生代谢物质合成[29,30]，表现为PAL、C4H和4CL等相关酶活性升高[18,19,29]，并且影响着植物体内次生代谢产物的积累[18,19,30].

干旱胁迫对植物体内次生代谢产物含量的影响通常与干旱程度有关.李继泉等[31]研究表明，在适度干旱胁迫下，植物可利用体内的氮素和碳素促使次生化合物的合成，进而使其含量增加.朱灿灿等[8]研究表明，适度干旱胁迫可以促进银杏黄酮类物质的合成，尤其是中度干旱胁迫能促进其叶片黄酮类物质合成.谢宝东等[32]的研究证实适度干旱胁迫能有效提高银杏黄酮类化合物含量，而在充足供水和淹水条件下，其黄酮类化合物含量均没有明显增加.也有研究表明酸枣、女贞和银杏在干旱胁迫下其叶片黄酮类化合物的积累没有明显变化[1,5,9,10].就肋果沙棘来看，试管苗叶片总黄酮含量在20% PEG-6000胁迫下含量明显下降外，其他浓度的PEG-6000胁迫对总黄酮含量均没有显著影响.由于不同植物中黄酮成分的种类和含量各槲皮素、山奈酚、异鼠李素和杨梅素是沙棘叶片的主要黄酮苷.以往的研究表明，沙棘叶片中槲皮素含量最高，其次是山奈酚，再次是异鼠李素，而杨梅素含量甚微，经常检测不到[24,25].本实验通过高效液相色谱法检测了肋果沙棘试管苗叶片的四种主要黄酮苷；槲皮素含量最高，其次是山奈酚，这与以往的研究结果一致[24,25].在水分充足的对照组中杨梅素含量高于异鼠李素，而在PEG-6000胁迫下异鼠李素含量均高于杨梅素.说明干旱胁迫能使肋果沙棘叶片异鼠李素含量增加，但不利于杨梅素的积累；并且，干旱胁迫对异鼠李素含量的影响最大，其次是杨梅素，再次是山奈酚，对总黄酮含量影响较小，而对槲皮素含量没有显著影响.

表2　干旱胁迫下肋果沙棘试管苗叶片酶活性及黄酮含量的相关系数(r2)

*P<0.05；**P<0.01异，所以不同学者对各种植物的黄酮成分受干旱胁迫的研究结果不尽相同.

肋果沙棘试管苗叶片PAL,C4H和4CL对干旱胁迫较为敏感，随PEG-6000胁迫程度的增加，这三种酶活性较对照显著升高.总黄酮、槲皮素、山奈酚、杨梅素含量的变化趋势与PAL、C4H和4CL活性的变化趋势正好相反.回归分析也显示这三种酶的活性与叶片黄酮类化合物含量存在负相关关系，这与在银杏叶片中的研究结果一致[18].其主要原因在于：苯丙烷类代谢的产物除黄酮类化合物外，还包括木质素等次生代谢物质[33]，而黄酮类化合物含量的高低除了与相关酶活性有关外还与次生代谢的中间产物向木质素、类黄酮等化合物中的分配有关.有研究显示，PAL、C4H和4CL活性与木质素含量呈显著正相关[20,21].当植物受到外界环境胁迫时，苯丙烷类代谢被激活，PAL和C4H活性升高，产生更多的木质素等能够减少外界环境胁迫对植物组织造成伤害的物质，进而保护植物组织[34].肋果沙棘试管苗在干旱胁迫下，苯丙烷类代谢被激活，PAL、C4H和4CL活性升高，而黄酮类化合物含量并没有提高，可能与更多中间代谢产物用于木质素等次生代谢产物的生物合成有关.

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(责任编辑俞诗源)

作者简介：孙坤(1965—)，男，甘肃民勤人，教授，博士，博士研究生导师．主要研究方向为系统与进化植物学．

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30160046，30960029)

收稿日期：2015-01-08;修改稿收到日期:2015-03-03

E-mail:kunsun@nwnu.edu.cn