孔璐，丁卫

（首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，北京100069）

细胞基因组“维稳”的DNA修复机制
——2015年诺贝尔化学奖介绍

孔璐，丁卫

（首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，北京100069）

适逢2015年的金秋十月国庆假期，10月7日北京时间下午5点45分，从瑞典皇家科学院传来消息：本年度的诺贝尔化学奖授予了托马斯·林道尔（瑞典）、保罗·莫德里奇（美国）和阿奇兹·桑贾尔（美国/土耳其），以表彰他们对细胞DNA 修复机制研究所作出的杰出贡献。3人将平均分享总值969000美元的奖金（图1）。

1 获奖者简介

林道尔（Lindahl，1938～）生于瑞典首都斯德哥尔摩。1967和1970年分别获得卡罗琳斯卡医学院（KarolinskaInstitutet）的博士（Ph.D）和医学博士（M.D.）。随后赴美国普林斯顿大学和洛克菲勒大学从事博士后研究。1978年任瑞典哥德堡大学（University of Gothen-burg）药物化学系教授。1986年至今担任英国弗朗西丝克里克研究所（Francis Crick Institute）研究员和克莱尔霍尔癌症研究室（Cancer Research UK at Clare HallLaboratory）的负责人。博士后期间，林道尔开始关注机体DNA稳定性的维持及其相关机制问题[1]：面对细胞基因组数以千计的损伤频率，生命的持续必然需要有一套不可或缺的DNA分子修复系统[2]。在后续35年的研究中，林道尔先后发现并鉴定了一系列DNA修复蛋白[3]。还在研究B淋巴细胞被EB病毒（Epstein-Barr virus）感染后DNA的改变时，首次鉴定出转化的淋巴细胞中存在二倍闭环病毒DNA[4]。1986年，林道尔通过总结在克莱尔实验室的工作，逐渐揭示出“碱基切除修复（base excision repair，BER）”分子机制的全部过程以及其中糖苷酶（glycosylases）的重要作用[5]。1996年，林道尔成功地在体外实验中对人体内的这种DNA修复机制进行了重构和确认。他同时指出，BER修复机制并不能完全保证细胞内DNA分子豁免损伤的出现和累积[6]，从而激励了研究者对其他机制的探索和发现。

莫德里奇（Modrich，1946～）出生于美国新墨西哥州。1973年在斯坦福大学获得博士（Ph.D）学位。现任美国杜克大学（Duke University）医学院的生物化学教授，以及霍华德·休斯医学研究所（Howard HughesMedical Institute，HHMI）的研究员。莫德里奇的研究兴趣集中在作用于DNA的酶类，包括DNA连接酶、DNA聚合酶以及限制性内切酶等。20世纪70年代末，莫德里奇的研究重点转移到一种称为Dam 的DNA甲基化酶。Dam可对DNA进行甲基化修饰，帮助特定的限制性内切酶对DNA分子特定位点的识别和切割。通过与哈佛大学的分子生物学家马修·梅赛尔森（Matthew Meselson）[7]的密切合作，他们于1976年发现了细菌DNA修复中的“限制－修饰”现象。通过构建一种携带数个碱基配对错误的DNA病毒，同时利用Dam对其DNA分子链进行甲基化修饰。在受这些病毒感染的细菌中，只有缺乏甲基化的DNA分子链可得到修正[8]。表明对配对错误的修正是DNA复制时的一种自然过程，而未甲基化充当了其过程中的参考模板。莫德里奇的研究还发现MutS和MutL基因的同源缺失可以成为遗传性非息肉结直肠癌发病的主要原因之一，其基因失活可直接导致肿瘤逃逸细胞凋亡并产生化疗耐药。经此后多年的系统性研究，随着多种参与分子的克隆，“错配修复机制（mismatch repair，MMS）”得到确认。20世纪80年代末，这一复杂的分子修复机制最终在试管中得到细致的重现[9]。

桑贾尔（Sancar，1946～）出生于土耳其的萨乌尔。在伊斯坦布尔的医学院毕业后，就读于美国得克萨斯大学达拉斯分校（University of Texas，Dallas），并且于1977年获得Ph.D学位。现任美国北卡罗来纳大学教堂山分校（University of North Carolina，ChapelHill）医学院的生物化学与生物物理学系教授。1973年，桑贾尔开始尝试破解一个神奇现象：蓝色光照可使经致命剂量紫外线照射的细菌复活[10]。在他1976年的博士毕业论文中，记载了DNA紫外线损伤修复酶——光修复酶（photolyase）基因的成功克隆和表达[11]。随后在耶鲁大学医学院的实验室工作中，在3种对紫外线敏感度不同的细菌中，UVRA、UVRB 和UVRC等不同的变异体被发现，进一步证明了光修复酶对紫外线所致DNA损伤的特异识别和修复功能，经过在受损片段上下游的2次切割，其中涉及12～13个核苷酸的片段可被移除。1983年，桑贾尔在发表了相关研究成果之后[12]，于北卡罗来纳大学受聘生物化学副教授，继续完成了“核苷酸切除修复（nucleotideexcision repair，NER）”机制的最终阐释[13]。

2 DNA损伤的修复机制

人类基因组中，DNA作为遗传信息的载体含约30亿个碱基对。细胞可通过半保留复制方式将DNA的碱基序列传递至子代。不论是在自然界环境中还是生物体内，除了DNA复制过程中的碱基错配及DNA分子本身的热不稳定性等因素以外，诱发DNA损伤的因素很多，如辐射、化学毒物、药物及病毒感染，以及机体代谢过程中所产生的自由基等有毒活性物质等等。这些因素的作用后果也因损伤的程度不同而表现出异常，包括单链断裂或单碱基破坏、大范围破坏或DNA交联、鸟嘌呤的O6甲基化、碱基错配的发生或DNA双链分子的断裂等等（图2）[14]。DNA损伤不仅可以造成DNA复制或者转录的障碍，也可能直接导致基因突变的发生。针对不同的DNA 损伤类型，细胞内存在多种DNA修复系统。已发现的类别因其机制不同主要分为：碱基切除修复（BER）系统、错配修复系统（MMR）、核苷酸切除修复（NER）系统、直接修复（direct repair，DR）、重组修复所包括的同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）等等。

1）碱基切除修复机制：BER被认为是真核细胞较为普遍的修复方式。20世纪70年代，人们多数认为由于DNA聚合酶同时具有校验功能，因而复制过程是非常忠实且合成产物也是极其稳定的。即使如此，包括林道尔等在内的研究人员提出复制这一复杂过程中难免存在碱基的错配问题，并且进而产生以一定速率累积增加的突变。随着糖苷酶的发现，BER修复系统及其工作机制终获得解析。在该系统中，糖苷酶能够识别受损的碱基，水解DNA分子的糖苷键，从而在核酸链的骨架上产生一个无嘌呤或嘧啶的位点（apurinic/apyrimidinic site，AP位点）[15]。在AP位点上，AP核酸内切酶水解5’-糖苷-磷酸键；AP核酸外切酶作用于其3’端下游；移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA；再由DNA聚合酶Ⅰ根据未损伤的互补模板合成新的修复片段；最终由DNA连接酶连接新修复的DNA链（图2）。

2）错配修复机制：MMS从某种意义上可以看成是BER的一种特殊形式。复制错误可导致新合成的链与模板间产生碱基错误配对，莫德里奇很早就意识到这一问题。在研究中发现并成功克隆了大肠杆菌（E. coli）错配修复系统中的3个关键分子（MutS、MutH和MutL）。该修复系统专用于校正新合成的DNA，因新DNA链GATC序列中的A未甲基化。MutS和MutL可识别错配的碱基，MutH负责在GATC的G位点切开非甲基化的子链。真核生物中错配修复机制与大肠杆菌的修复模式非常相似。人类基因中存在与MutS高度同源的MSH2、MSH6和MSH3等。错配修复系统的分子机制也常常被用来部分介导DNA损伤后的细胞应激反应。

3）核苷酸切除修复机制：NER识别DNA双螺旋的构象改变而非特定碱基的损伤，这种桑贾尔在光修复系统研究中的发现与BER的情况颇为不同，可分为全基因组型和转录偶联型2种。大肠杆菌的NER主要由4种蛋白UvrA、UvrB、UvrC和UvrD组成。UvrA识别DNA双螺旋结构变形；UvrB负责解链，募集核酸内切酶UvrC，在错配位点上下游数个碱基的位置上将DNA链切开；UvrC在损伤部位的两侧切断DNA链；UvrD去除两个切点间的DNA片段；DNA聚合酶合成新链填补空隙；连接酶将新片段与原DNA连接。真核生物的NER机制与原核相仿，然而过程更为复杂；人NER修复系统的XPA、XPC、XPD、XPF和XPG等基因与常染色体隐性遗传病着色性干皮病（xeroderma pigmentosum，XP）存在关联。

4）其他重要的DNA 修复机制：重组修复（recombinational repair）是可以发生在DNA的双链或双链中的一条链发生断裂时。在DNA复制过程中，由于损伤部位失去模板作用，造成互补的DNA链不能合成，形成缺口。这时从亲代DNA的对应部位可提供帮助将缺口进行填充，以产生完整的子代DNA；直接修复主要用于去除O6甲基化的鸟嘌呤并完成后续的碱基修复置换与DNA连接，其中O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶［O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT］是发挥决定性作用的修复酶，其功能异常与以神经多形性胶质母细胞瘤（glioblastomamultiforma，GBM）为代表的许多肿瘤的进展及预后关系密切；跨损伤DNA合成（trans-lesion DNA synthesis，TLS）是另一较新发现的DNA 修复机制，以应对无错损伤旁路（error-free lesion bypass）及易错损伤旁路（error-prone lesion bypass）所导致DNA 损伤及其诱导的突变。以上述多种类型为例的各种DNA修复机制协同工作，在维护细胞基因组的稳定性以及DNA序列高保真性传递核传代中发挥着极其重要和难以替代的作用。

3 高通量测序和组学分析背景下的DNA修复机制研究及其与疾病和医药的联系

修复系统的存在保证了物种遗传的稳定性，对降低修复缺陷相关疾病的发病率有十分重要的意义。虽然细胞总是会千方百计地维持基因组的稳定性或控制其只完成既定分化程序所允许的改变，然而在环境和刺激因素的作用下，错误总是存在并且随时发生。当DNA碱基的错误未能得到纠正并且被累积，突变由此产生。广泛和大量的基因突变是肿瘤发生的根源。3位科学家很早就意识到基因组的不稳定性与癌症之间的密切关系，无论是在癌症的发生还是在抗癌药物的治疗过程中，几种修复系统的作用是相互联系和复杂交叉在一起的，如图3所示。这充分提示了，与过去研究DNA损伤修复的经典策略不同，利用高通量测序和组学研究技术在全基因组水平的综合分析将为这一领域的进展带来前所未有的突破机遇，同时将大大加深对包括肿瘤在内的人类复杂疾病的病理认识，特别是在解析基因由环境因素所累积的变异方面。

桑贾尔的研究团队发现致癌药物环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimmers，CPDs）和化疗药物双氢顺铂（cisplatin 1，2-d，GpG）共同作用下，NER修复机制使得DNA分子经过两次切割可清除24～32个损伤的碱基，他们将这一过程中的6个关键修复因子（XRPA，XPA，XPC，TFIIH，XPG和XPF-ERCC1）一一纯化，用于分离DNA片段进行深度测序，以便在离体实验中进一步分析和阐明人类切除修复的细节机制。特别需要指出的是，他们从辐射后的正常人类成纤维细胞及突变细胞系DNA分离得到与转录因子TFIIH紧密结合的含有30个碱基的复合体，进行了深入的高通量测序和基因组学分析（图3），成功地绘制出NER修复及转录偶联修复的人类全基因组图谱[16]，并以此为例，建立了一套稳定的方法和流程，将这项技术命名为XR-seq（Excision Repair-Sequencing）。另一个此类基于染色质免疫沉淀和高通量测序的鉴定DNA易损位点的方案称为SPI-Seq（single-strand DNA (ssDNA)-associated protein immunoprecipitationfollowed by sequencing）[17]。该方法以裂殖酵母为模式生物，可检测结合单链DNA的Rad52等修复蛋白的基因组分布，用于揭示其结合单链DNA的序列特异性。将HO内切酶识别序列引入基因组作为标签，验证出SPI-Seq能检测到Rad52在HO诱发的DNA双链断裂处单链DNA上的特异分布，研究中还检测到了基因组中以较低频率发生的内源HO识别序列上的双链断裂位点。同时在几个基因组低稳定性的裂殖酵母突变体中利用该项技术还发现了在野生型菌体中所不易观察到的DNA易损位点。美国麻省总医院的研究团队在去年也开发了在基因组范围内检测CRISPR脱靶效应的新方法GUIDE-seq（genome-wide unbiased identification of DSBsevaluated by sequencing），除了可用于基因编辑工具的作用和效果评价，在DNA损伤修复和癌症研究领域也同样具有广阔的应用前景。与此同时，充分发展和利用高敏感性的荧光PCR技术也可以为定量分析、发现和验证特定基因变异对DNA修复机制的影响和细胞基因组稳定性后果等提供重要的支持[18]。

在诺贝尔评审委员会对2015年度化学奖的评论中特别提到了3位科学家的工作将为癌症的治疗突破带来鼓舞和希望。而事实上，一些研究人员已经在努力尝试根据各种DNA修复机制中的不同靶点分子设计开发新型的抗癌药物，在更有效阻止癌细胞生长的同时，避免和减少传统化疗过程中出现的耐药现象。例如，即将完成多种临床试验的PARP-1［Poly(ADP-ribose) polymerase 1］抑制剂AZD2281（olaparib）等[19]。除肿瘤外，各种由致病性病毒引起的各种感染性疾病，以及环境辐射与化学品暴露所致的健康和遗传问题，都可能从该化学奖的直接成果和思路提示中获益。然而我们必须也认识到：1）DNA修复机制的研究进展历经了全球许多勤奋和有天赋的科学家长达数十年的艰苦努力，值得表彰的学者应该还有很多。2）人类试图战胜肿瘤这一恶性疾病的努力一直在继续，然而至今尚未能获得令人满意的战果，本年度诺贝尔化学奖固然使得癌症的研究者和临床工作者再次振奋希望，但我们理应意识到疾病本身的复杂性和后续工作的艰巨。

摘编自《首都医科大学学报》2015年36卷第5期：823-828页，图、参考文献已省略。