王萍，王攀，陈建彪，董丽娜，赵明明，严伟，丁华，周有祥

摘要：真菌毒素是丝状产毒真菌生长过程中分泌的对人畜健康有害的次级代谢产物，广泛存在于多种农产品中。对已建立的同时检测黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素和桔霉素的方法，对其方法检出限、定量限、精密度和回收率进行了评价。该方法对上述4种真菌毒素的检出限分别为2.12、5.46、2.39和53.10 μg/kg，定量限分别为8.48、21.82、9.57和212.38 μg/kg;加标回收试验中4种毒素的回收率分别为81.43%，75.19%，80.44%和98.54%。该法简单、快速、高效，适合于批量样品分析，具有应用推广前景。

关键词：真菌毒素;同时检测;检出限;定量限;回收率

中图分类号：O657.7        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5839-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.055

真菌毒素（Mycotoxin）是丝状真菌生长过程中产生对人畜健康有害的次级代谢产物，被联合国粮农组织列为食源性疾病的3大根源之一[1，2]。常见真菌毒素包括：黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）和桔霉素（Citrinin，CIT）等，主要来源于3个属，曲霉属、青霉属和镰刀菌属[2]。由于产毒真菌多为腐败菌，极易在农产品的生产、运输、加工、储藏和销售等过程中污染农产品，但在现有生产力条件下，尚无法完全杜绝真菌毒素进入人类食物链[3]。农产品一旦被产毒真菌侵染，不仅带来经济损失，也严重威胁到消费者健康，为了控制真菌毒素对危害，世界各国均制定了严格的真菌毒素限量标准。

目前，真菌毒素的检测方法绝大部分为单一毒素或者同类毒素的分析方法，但这类方法成本高，或者重现性差[4]，而且真菌毒素分布广，对全部毒素进行分析，不仅效率低，成本高，环境污染也大[5，6]。因此建立高通量、准确、快速和低成本的真菌毒素检测技术，对于保障食品安全问题具有较好的现实意义。本试验依据本课题组已建立的AFB1、CIT、OTA和ZEN同时提取和检测的HPLC方法，对该法的检出限、定量限、精确度以及回收率等4个指标进行分析，探讨本方法的适用性。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

大米样品为实验室收集的无污染稻米样品。4种真菌毒素标准品购于瑞士Alexis公司，纯度大于98%。常规试剂均为分析纯试剂，购于国药集团化学试剂有限公司;试验用水为去离子水。

1.2  仪器与设备

2695-2475型高效液相色谱仪-多通道荧光检测器（HPLC-FLD）（Waters，美国）;Laborota-4010型旋转蒸发仪（Heidolph，德国）;MS1振荡器（IKA，德国）。

1.3  方法

1.3.1  真菌毒素混合标准储备液  分别称取一定量AFB1、CIT、OTA和ZEN的标准品，用甲醇稀释为30 μg/mL的AFB1、CIT、OTA和ZEN的标准储备液，密封后，避光4 ℃冷藏。

1.3.2  标准曲线的绘制  取适量的储备液，以乙腈配制5个不同浓度的混合标准溶液。用HPLC进行分析，以峰面积为纵坐标，毒素绝对量为横坐标绘制标准曲线。

1.3.3  样品分析  具体方法参考文献[7]。

1.3.4  方法检测限  根据上述分析方法，参照文献[8]，以产生仪器信噪比2～5倍响应值所对应浓度（含量）的样品进行7次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按照公式（1）计算方法检出限，并以3倍方法检出限作为方法的测定下限。

方法检出限=t（n-1，0.99）×S（1）

其中：n为样品平行测定的次数;t为自由度，为n-1，置信度为99%时的t分布（单侧）;S为n次平行测定的标准偏差。当自由度为n-1，置信度为99%时的t值为3.14。

1.3.5  方法精密度  配制含不同浓度毒素的标准溶液做精密度测定，各个样品平行测定7次。

1.3.6  回收率分析  分别在大米样品中添加3个水平的真菌毒素标准品，按照标准方法的分析步骤进行回收试验，平行测定7次，计算其相对误差和相对误差的最终值。

2  结果与讨论

2.1  标准曲线

分别以4种真菌毒素的峰面积为纵坐标，毒素绝对量为横坐标，得到的标准曲线方程分别为：黄曲霉毒素B1为y=842 680x+112 127，R2=0.991 8;桔霉素为y=2 101 766x-42 328，R2=0.990 0;赭曲霉毒素A为y= 2 948 377x-1 586 502，R2= 0.999 2;玉米赤霉烯酮为y=279 111x-114 263，R2=0.998 4。

2.2  真菌毒素的色谱图

采用上述液相条件，4种真菌毒素的色谱图见图2。

2.3  方法检出限与定量限

按照上述样品检测步骤，以产生仪器信噪比3倍响应值所对应浓度样品进行7次平行测定，计算测定结果的标准偏差，按公式（1）计算方法检出限和定量限，计算结果见表1。

由表1可知，该法中AFB1、CIT、OTA和ZEN 4种真菌毒素的检出限分别为2.12、5.46、2.39和53.10 μg/kg，定量限分别为8.48、21.82、9.57和212.38 μg/kg。

2.4  方法精密度

以不同浓度水平的4种标准溶液，平行测定7次，结果如表2所示。

由表2可知，各毒素测定的相对标准偏差均小于5，表明本方法精密度良好。

2.5  回收率分析

按照表3，在7份平行大米样品中各添加3个水平的AFB1、CIT、OTA和ZEN标准品后，采用上述前处理和检测方法进行分析，其计算结果如表4所示。

在回收率分析中，加标水平2为国家的限量标准[9]（CIT的限量值参考文献[10]）。由上述结果可知，大米中AFB1、OTA和ZEN的回收率均大于80%，CIT的回收率在75%左右。在加标水平3即高于国家限量标准（CIT参考轻工业行业标准QB/T 2847-2007）条件下，大米中AFB1、CIT、OTA和ZEN的回收率均高于80%。7次平行测定的回收率的标准偏差为1.22%～5.81%，相对标准偏差为1.50%～6.00%，准确度和精密度均可满足同时对AFB1、CIT、OTA和ZEN的分析。

3  小结与讨论

作为当前真菌毒素检测方法的研究热点，多真菌毒素较之传统单一毒素检测方法，具有灵敏度高、通量大、周期短、成本低、重现性好等特点。目前，高通量真菌毒素检测方法最多可同时检测23种真菌毒素[11]，但这类方法仅被部分有条件的实验室采用，目前难以推广。随着我国经济和科技水平的提高，高效液相色谱仪已成为我国各级实验室的基本配备仪器，因此建立多真菌毒素的同时提取，同时检测高效液相色谱检测技术将有助于真菌毒素检测技术在基层的推广，保障食品安全。通过对已建立方法的检出限、定量限、精密度和回收率分析，表明该方法可满足稻米样品中主要真菌毒素同时分析需求，可显著检测效率，有利于保障食品安全，具有较好的应用前景。

参考文献：

[1] WHO.WHO Global Strategy for Food Safety： safer food for better health.Food Safety Programme 2002[M]. Geneva， Switzerland：World Health Organization， 2002.

[2] 王  君，刘秀梅.食品中真菌毒素危险性分析的方法及现状[J].中华预防医学杂志，2005，39（6）：430-433.

[3] 王向红，刘  涛，王忠斌，等.高效液相色谱法同时测定谷物中的赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮[J].中国食品学报，2008，8（5）： 148-152.

[4] 李  军，于一茫，田  苗，等.免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生-高效液相色谱法同时检测粮谷中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A[J].色谱，2006，24（6）：581-584.

[5] AURELIEN D， OBERSON J M， PATRICIA T， et al. Development and Comparison of Two Multiresidue Methods for the Analysis of 17 Mycotoxins in Cereals by Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58（13）： 7510-7519.

[6] SONGSERMSAKUL P， FAZELI E R. A review of recent trends in applications of liquid chromatography-mass spectrometry for determination of mycotoxins[J]. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies， 2008， 31（11）： 1641-1686.

[7] DB 42/T 808-2012，饲料中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和桔霉素的测定高效液相色谱法[S].

[8] GB/T 6379.4-2006，测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第4部分：确定标准测量方法正确度的基本方法[S].

[9] GB 2761-2011，食品安全国家标准食品中真菌毒素限量[S].

[10] QB/T 2847-2007，功能性红曲米粉[S].

[11] DIANA D J， MONBALIU S， SCIPPO M L， et al. LC-MS/MS multi-analyte method for mycotoxin determination in food supplements[J]. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess，2009，26（6）：885-895.