王婧，周有祥，严伟，丁华，赵明明，刘浩，杨洁

摘要：以黑米为材料，采用HPLC-DAD法和UPLC-MS/MS法，鉴定其中的花青素主要为矢车菊素-3-葡萄糖苷，并采用HPLC-DAD法对其进行定量分析。结果表明，黑米中的矢车菊素-3-葡萄糖苷含量达（1.017±0.028） mg/g，远高于另外5种有色稻米中的矢车菊素-3-葡萄糖苷含量。该方法准确、灵敏、高效、稳定，可用于高花青素含量的黑米品种筛选。

关键词：黑米;花青素;矢车菊素-3-葡萄糖苷;超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）;高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）

中图分类号：O657.7+2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5836-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.054

有色稻米是中国极其珍贵的特异水稻种质资源，其糙米（颖果）带有异于普通稻米的色泽，成色原因正是由于稻米种子发育过程中种皮沉积了大量花青素[1，2]。就种皮颜色而言，可分为紫（黑）米、红米、黄米和绿米，其中以紫（黑）米和红米最常见[3]。花青素（Anthocyanins）是广泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，属于黄酮类物质，在自然状态下多以糖苷化和酰基化的形式存在，称为花色苷[4]。Abdel-all等[5]研究结果认为，组成黑米与红米的主要花青素苷为矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside， C-3-G）。施怡如等[6]对具紫色植株的水稻品种Purpleputtu的研究表明，该植株紫色或红色的组织中均含有花青素，其中主要成分为矢车菊素（Cyanidin），而花青素含量最多的部位就是颖果皮。Reddy等萃取紫黑色、白色、褐色颖果皮的试验表明，白色及褐色颖果皮的水稻品种并未检测到花青素，但大部分紫黑色颖果皮的品种含有Cyanidin-3-glucoside和Peonidin-3-glucoside两种花青素，且以Cyanidin-3-glucoside为主要成分，颜色愈深的颖果皮含有较多的花青素。

长期以来，对黑米评价研究主要集中在农艺性状和主要营养成分的分析，而对其生理活性物质方面的研究较少[7]。根据国内外研究现状，目前花青素常用的检测方法有可见分光光度法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法等[8-10]。但单纯使用UV或HPLC均存在检测灵敏度低、检测用时长等不足[11]。超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）具有选择性好、灵敏度高、重复性好等优点。本试验以黑米为试验材料，建立UPLC-MS/MS测定方法，分析黑米中矢车菊素的含量，旨在为有色稻米花青素的组分分析提供新的方法，可用于从有色稻米种质资源中筛选高花青素含量的品种。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

黑米样品：黑津原1号，由天津市原种场提供，其他样品由本实验室提供;矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-g1u）标准品（纯度98%）购自百灵威科技有限公司;常规试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;试验用水为去离子水。

1.2  仪器

Waters 2695-2998型高效液相色谱仪-二极管阵列检测器（Waters，美国）;KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;Laborota-4010型旋转蒸发仪（Heidolph，德国），MS1振荡器（IKA，德国）;ACQUITY UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱系统（Waters，美国），配有电喷雾离子源（ESI）及MassLynx 4.1数据处理系统。

1.3  方法

1.3.1  前处理  将适量黑米样品用旋风磨粉碎，过80目筛，获得试验用黑米粉。准确称取5 g样品于250 mL三角瓶内，加入50 mL 90%甲醇溶液（含0.1%盐酸，V/V），超声提取30 min，将样品提取液通过滤纸，过滤至100 mL棕色容量瓶中，重复提取两次，合并两次提取液，摇匀，甲醇定容，过0.22 μm滤膜后，待测。

1.3.2  标准溶液的配制  精确称量Cy-3-g1u标准品1.08 mg，用甲醇溶解定容至10 mL，得到108 μg/mL的标准溶液。使用前配制成不同浓度的标准溶液。

1.3.3  液相色谱条件  Inertsil ODS-3 色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm） ，流动相A（0.1%甲酸溶液）-B（含0.1%甲酸的甲醇溶液），流速为0.8 mL/min;梯度洗脱：0～5 min，A∶B（10∶90～30∶70）;5～12 min，A∶B（30∶70～50∶50）;12～15 min，A∶B（10∶90）;检测波长为519 nm;柱温为30 ℃;进样量为10 μL。

1.3.4  超高效液相色谱-质谱条件  UPLC条件：色谱柱Acquitytm UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A（0.1%甲酸溶液）-B（含0.1%甲酸的甲醇溶液），等度洗脱（20%B），流速为0.2 mL/min，柱温为30 ℃。

质谱条件：MS条件自动优化，ESI+全扫描模式;毛细管电压3.0 kV;锥孔电压30 V;二级锥孔电压3 V;离子源温度：150 ℃;脱溶剂气温度350 ℃;脱溶剂气流量300 L/H;锥孔气流量40 L/H。

1.3.5  回收率试验  称取0.9 g精白米粉（预实验表明不含Cy-3-g1u）3份，分别加入0.1 g黑米粉样品，按照供试品溶液制备，采用HPLC方法分析样品中的Cy-3-g1u含量。

回收率=m1/m2×10×100%，其中：m1为混入黑米以后精白米样品中的Cy-3-g1u含量，mg/g;m2为黑米样品中的Cy-3-g1u含量，mg/g;10为精白米-黑米混合物和混入的黑米的质量比。

2  结果与分析

2.1  矢车菊素的定性分析

文献报道，花青苷类化合物分别在265～275 nm和 465～560 nm处有 2个特征吸收峰[4，12]。本黑米样品中存在11.6 min处色谱峰的光谱图（λmax=280， 519 nm）与报道一致（图1），初步确定样品中含有花色苷。随后收集HPLC色谱的流出组分，并采用UPLC-MS/MS法对该峰进行分子量的分析，结果见图2。由图2可知，在正离子模式下，11.6 min的色谱峰出现两个离子峰，分别为m/z=449和287，参考文献[11]，确定11.6 min的色谱峰为Cy-3-g1u，其中m/z=449为Cy-3-g1u的母离子[M+H]+;m/z=287为Cy-3-g1u在质谱条件下，糖苷键断裂，仅有矢车菊素的碎片峰[M-Glucose+H]+。

为进一步确证该化合物为Cy-3-g1u。本试验以Cy-3-g1u标准品进行对照，标准品的HPLC图谱见图3。由图3可知，样品和Cy-3-g1u标准品的保留时间和光谱图一致，故可判断黑米样品中11.6 min处的色谱峰为Cy-3-g1u。

2.2  矢车菊素的定量分析

2.2.1  标准曲线的制作  将不同质量浓度的矢车菊素-3-葡萄糖苷的标准品溶液进行HPLC分析，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（图4）。由图4可知，当矢车菊素-3-葡萄糖苷质量浓度在20～150 μg/mL时，Cy-3-g1u与峰面积呈良好的线性关系，回归方程y=32 765x-19 988，R2= 0.998 3。

2.2.2  回收率试验  为验证本方法的准确性，采用样品加标方法进行回收率试验。由于Cy-3-g1u标准品含量过低，因此，本试验将高含量的样品黑津原1号加入到精白米样品混匀后，进行含量分析，以测定结果与混入样品质量的百分比为回收率。结果表明，3个平行样品的Cy-3-g1u回收率分别为93.4%、90.4%、101.9%，平均值为95.2%，RSD为6.27%。该方法虽然不及直接使用标准品的精密度高[12，13]，但测得的回收率的相对标准偏差小于8%，也在可接受范围内，并且节约了成本高昂的Cy-3-g1u标准品用量。

2.2.3  样品分析  采用HPLC法分析黑津原1号和本实验室的5份有色稻米中的Cy-3-g1u含量，结果见表1。由表1可知，黑津原1号的Cy-3-g1u含量远高于其他5份样品（达到中科黑糯1号的46倍），也远高于应龙彬等[12]的报道，可推断为矢车菊素-3-葡萄糖苷含量较高的一个品种。

3  小结与讨论

HPLC法是依据样品保留时间与标准品的保留时间一致作为鉴别标准进行分析，而UPLC-MS/MS法是通过对母离子、子离子和保留时间等多重标准进行定性、定量分析，结合了色谱法的高分离能力和质谱法的高鉴定能力，最适合分析多组分混合物中未知组分。结果也显示出不同样品的矢车菊素-3-葡萄糖苷含量差异巨大，表明本研究建立的UPLC-MS/MS分析黑米中花青素的方法具有准确度高、灵敏度高、高效可靠等特点，可用于从有色稻米种质资源中选育高花青素含量的品种。花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定的营养保健功能，花青苷类色素具有降低冠心病发病率、改善视敏度、抗氧化和抗癌活性[14]，在食品、化妆品、医药等方面有着巨大的应用潜力[15]，因此研究和开发高花青素含量的有色稻米品种拥有良好的发展前景。

参考文献：

[1] 韩  磊，吴先军，张红宇，等.黑米果皮花色素沉积过程的研究[J].中国水稻科学，2006（4）：384-388.

[2] 王倩倩，王鹏飞，李先恩，等.云南不同品种有色稻米HPLC指纹图谱的建立及质量评价[J].中国农学通报，2012，28（12）：99-104.

[3] 童继平，李素敏，刘学军，等.有色稻米研究进展[J].植物遗传资源学报，2011，12（1）：13-18.

[4] 薛晓丽.HPLC法测定黑米中花青素的主要成分及含量[J].安徽农业科学，2009，37（11）：4854-4855.

[5] ABDEL-AAL E S M， YOUNG J C， RABALSK I I. Anthocyanin compositon in black， blue， pink， purple， and red cereal grains[J].  J Agric Food  Chem， 2006， 54： 4696-4704.

[6] 施怡如，郑统隆，曾东海，等.有色水稻中花青素的种类及其功能探讨[J].中华农业研究，2004，53：221-228.

[7] 张名位，郭宝江，池建伟，等.不同品种黑米的抗氧化作用及其与总黄酮和花色苷含量的关系[J]. 中国农业科学，2005，38（7）： 1324-1331.

[8] HARBORNE J B. Spectral methods of characterizing anthocyanins[J]. Biochem J，1958，70（1）：22-28.

[9] 韩  豪，李新生，张志键，等.膜技术在黑米花青普色素脱脂和浓缩中的应用[J].食品科学，2012，33（6）：297-300.

[10] 毛建军，付成平，郭灵安，等.可见分光光度法测定紫甘薯总花青素含量[J].食品与发酵科技，2010，46（2）：201-204.

[11] 高  玥，李新生，韩  豪，等.UPLC-MS/MS定性测定紫薯花青音方法研究[J].食品工业科技，2013，34（3）：317-320.

[12] 应龙彬，俞桑桑，刘催萍，等.高效液相色谱法对黑米中花色苷成分的测定[J].杭州师范大学学报，2012，11（1）：28-32.

[13] 张芳轩，张名位，张瑞芬，等.黑米种皮中花色苷组成及含量的HPLC分析[J].中国粮油学报，2010，25（12）：122-125.

[14] 孙妩娟，靳玲侠，赵蔡斌，等.高效液相色谱-串联质谱联用法对黑米色素的组成和结构分析[J].理化检验-化学分册，2012， 48（9）：1023-1026.

[15] 段玉清，谢笔钧.原花青素在化妆品领域的研究与开发现状[J].香精香料化妆品，2002（6）：23-26.