高虹，程薇，史德芳，范秀芝，薛淑静，周康

摘要：采用纤维素酶（A）和中性蛋白酶（B）复合酶系水解香菇柄，确定香菇（Lentinus edodes）柄中风味成分最佳溶出条件。以可溶性蛋白质溶出率和氨基酸释放率为评价指标，分别考察酶A水解时料液比、pH、添加量、酶解温度及酶解时间和酶B水解时pH、添加量、酶解温度和酶解时间对提取率的影响;以游离氨基酸、呈味核苷酸、多糖的溶出率和酶解液感官品质为评价指标，比较了热水浸提法、纤维素酶单酶解法、复合酶解法3种方法的优劣。结果表明，最适酶解工艺条件为先以0.2%食用菌水解酶A，料液比（m∶V）为1∶6，pH 4.5，温度55 ℃的条件酶解2 h，在此条件下可溶性蛋白质溶出率为4.12%，然后在酶解液中加入0.15% 酶B，于pH 6.5，温度50 ℃酶解6 h，在此条件下总氨基酸释放率为2.16%;复合酶法水解香菇柄所得游离氨基酸、呈味核苷酸、多糖含量、感官评分分别为2.16%、1.57%、7.25%、82分，均优于另外2种方法。

关键词：香菇Lentinus edodes）柄;纤维素酶;中性蛋白酶;复合水解

中图分类号：S646.1+2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5823-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.051

香菇（Lentinuus edodes）属担子菌纲、伞菌目、口蘑科、香菇属，是继双孢菇之后的世界第二大食用菌，在民间素有“山珍”之称。中国香菇出口贸易量近10年逐步上升，居世界第一位[1]。香菇柄约占香菇干重的20%～30%[2]，因粗韧难嚼，吞咽困难，为了保证香菇的质量和满足出口要求，必须将其除去。据不完全统计，仅湖北省，香菇加工中每年产生2万t左右的菇柄，绝大部分都被废弃，造成了极大的资源浪费。

香菇柄中含有大量的营养活性成分，其中以香菇多糖和膳食纤维最为突出[3-5]。前期本课题组以香菇柄膳食纤维和活性多糖为目标，进行了深入研究[6-9]。实际上，香菇柄中风味成分的含量也十分丰富，由于纤维类物质的包裹，菇柄的风味成分很难释放，其鲜香味远不如香菇菇盖浓郁醇厚。本研究拟应用生物酶解技术，使菇柄风味成分高效释放，以期为利用菇柄开发菌类调味品提供理论支撑。

1  材料与方法

1.1  材料

香菇柄：由湖北裕国菇业股份有限公司提供;食用菌水解酶，由酶A（纤维素酶）和酶B（中性蛋白酶）组成，南宁庞博生物工程有限公司提供;纤维素酶，上海东风生化技术有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2  仪器设备

电热恒温水浴锅（DZKW-D-2型，北京市永光明医疗仪器厂）;紫外可见分光光度计（T6新世纪型，北京普析通用仪器有限公司）;旋转蒸发仪（RE-52型，上海亚荣生化仪器）;循环水式真空泵[SHZ-D（Ш）型，巩义市予华仪器有限责任公司];植物粉碎机（LG-500A型，瑞安百信药机械厂）;低速自动平衡离心机（DT5-4B型，北京时代北利离心机有限公司）;SW-CJ-1FD型超净工作台（苏州净化设备厂）;自动精密酸度计（pHS-3C型，上海雷磁分析仪器厂）。

1.3  试验方法

1.3.1  复合酶解工艺工艺流程  香菇柄→粉碎→加水混合→调pH→加热→加入酶A保温酶解→再次调pH→加入酶B保温酶解→灭酶→过滤→低温减压浓缩→冷藏备用[10]。

酶A酶解试验：加入食用菌水解酶酶A进行酶解试验，以样品的可溶性蛋白质含量为指标，分别考察料液比、pH、酶A添加量、酶解温度和酶解时间对酶解的影响。

酶B酶解试验：取酶A酶解处理后的样品，加入酶B进行酶解试验，以样品的氨基酸含量为指标，考察pH、酶B添加量、酶解温度和酶解时间对酶解的影响。

1.3.2  纤维素酶单酶法酶解工艺  工艺条件参照文献[11]，即：加酶量0.5%、酶解时间2 h、料液比1∶25（m∶V，下同）、pH 6.0、酶解温度50 ℃。

1.3.3  热水浸提法工艺  工艺条件参照文献[12]，即：料液比1∶30、浸提温度70 ℃、浸提时间2 h，提取2次。

1.3.4  不同工艺香菇柄中活性成分释放率的比较   对热水浸提法、纤维素酶单酶法、复合酶解法3种方法释放香菇柄中游离氨基酸、呈味核苷酸、多糖的效果进行比较。

感官评分：选取9个经过严格培训的评定员组成感官鉴定小组，对不同工艺得到的酶解液的色泽外观和风味进行综合评价。总分满分为100，色泽外观、风味的评分根据各项指标所占比例（20%、80%）的不同，计算最终得分，评分标准如表1所示。

1.4  测定方法

可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法;游离氨基酸含量测定参照GB/T5009.124—2003 的方法;呈味核苷酸测定参照SB/T 10484—2008的方法;粗多糖含量测定参照NY/T 1676—2008的方法。

2  结果与分析

2.1  酶A酶解工艺优化

2.1.1  料液比对可溶性蛋白质溶出率的影响  取一定量香菇柄粗粉，分别按料液比1∶3、1∶6、1∶12、1∶24加水，加入酶A，用量（以底物的质量计算，下同）0.20%，在pH为4.5的条件下恒温55 ℃水解2 h。由图1可知，可溶性蛋白质溶出率随着料液比的倍数增加而升高，当料液比高于1∶6时，可溶性蛋白质溶出率增长趋缓，继续提高料液比，可溶性蛋白质的溶出率仍有升高，但提高的量不明显;若料液比过低则提取不彻底，而料液比过高，则降低了提取液的固形物含量，浓缩成本较大，不利于以后的分离。因此，确定料液比为1∶6。

2.1.2  pH对可溶性蛋白质溶出率的影响  取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A用量0.20%，在不同pH （3.5、4.5、5.5、6.5）条件下恒温55 ℃水解2 h，结果见图2。由图2可知，可溶性蛋白质溶出率随着pH的升高先增加后降低，pH 在4.5时可溶性蛋白质的溶出率最高，可能的原因是每种酶都有一个最适pH，当在此条件下反应时，酶的活性最高，反应条件与其偏离的越远，酶的活性越低，从pH作用的范围来看，酶A这种纤维素酶最适pH为4.5。

2.1.3  酶A添加量对可溶性蛋白质溶出率的影响

取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，选择不同酶A添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），在pH为4.5条件下保温55 ℃水解2 h，结果见图3。从图3可以看出，可溶性蛋白质溶出率随着加酶量的增加而升高，当酶添加量达到0.2%后，再增加酶用量，可溶性蛋白质溶出率增加缓慢，这可能是由于在低酶浓度的情况下，底物能够完全与酶结合，从而破坏细胞壁，使其内容物释放，但在较高酶浓度情况下，底物不能对酶达到饱和，从而使一部分酶分子无法发挥效用。此外，从经济效益出发，酶添加量不宜过高，因此取0.20%为宜。

2.1.4  酶解温度对可溶性蛋白质溶出率的影响  取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A添加量0.20%，pH 4.5条件下，选择在不同温度（40、45、50、55、60 ℃）水解2 h，结果见图4。每种酶都有一个最适温度，当在此条件下反应时，酶的活性最高，反应条件与其偏离的越远，酶的活性越低。由图4可知，在较低温度范围内，随着温度的上升酶活性也随之提高，可溶性蛋白质的溶出增多，在55 ℃左右达到最高，随着温度继续上升将使酶的稳定性下降，部分酶蛋白分子开始失活。因此，选择酶解温度为55 ℃适宜。

2.1.5  酶解时间对可溶性蛋白质溶出率的影响  取一定量菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A用量0.20%，pH 4.5，温度55 ℃，选择在不同时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）内进行酶解，结果见图5。由图5可知，随着酶解时间的延长，可溶性蛋白质溶出率逐渐增加，当酶解时间超过2.0 h后，可溶性蛋白质溶出率增加趋缓，可能是在较短的反应时间内，酶分子快速破坏细胞壁，使细胞内容物释放，随着时间的延长，细胞壁已经被完全破坏，内容物已充分溶解，使得可溶性蛋白质溶出率升高趋势变缓，因此，酶解时间确定为2.0 h。

由以上分析可知，食用菌水解酶酶A的酶解工艺条件为料液比1∶6，酶A添加量0.20%，最适pH 4.5，温度55 ℃，酶解2.0 h，在此条件下可溶性蛋白溶出率为4.12%。

2.2  酶B酶解条件

2.2.1  pH对氨基酸释放率的影响  取酶A酶解处理后的样品，选取不同pH （3.5、4.5、5.5、6.5、7.5），酶B添加量0.1%，温度50 ℃，酶解4 h，结果见图6。氨基酸的释放率随着pH的升高而增加，至6.5左右达到最高，随后出现下降，由反应结果可知，该酶的pH作用范围为6～7，因此选择pH为6.5。

2.2.2  酶B添加量对氨基酸释放率的影响  取酶A酶解处理后的样品，选取不同的酶B添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%），pH 6.5，温度50 ℃，酶解4 h，结果见图7。由图7可知，随着酶添加量的增加，氨基酸释放率上升，达到0.15%后，继续提高添加量氨基酸释放率上升平缓。综合考虑成本等因素，选择酶B添加量为0.15%。

2.2.3  酶解温度对氨基酸释放率的影响  取酶A酶解处理后的样品，选取在不同温度（30、40、50、60 ℃）下，酶B添加量为0.1%，pH 6.5，酶解4 h，结果见图8。由图8 可以看出，温度对氨基酸释放率影响较大。随着温度的升高，氨基酸释放率先增加后降低，温度低于30 ℃或高于60 ℃均不利于水解，最适温度为50 ℃。

2.2.4  酶解时间对氨基酸释放率的影响  取酶A酶解处理后的样品，选取不同处理时间（2、4、6、8 h），酶B添加量为0.1%，温度50 ℃，pH 6.5，结果见图9。由图 9 可知，随着酶解时间的延长，氨基酸的释放率也随之增加，当酶解时间超过6 h 后，氨基酸释放率的增幅趋于平缓，可能是在较短反应时间内，酶分子快速破坏蛋白质分子，使其快速转化为氨基酸，随着时间的延长，蛋白质分子大部分被水解成了多肽和氨基酸，使得氨基酸释放率升高趋势变缓，考虑到实际生产情况，挥发性物质因水解时间过长损失较大， 对产品的滋味和气味不利，酶解作用6 h 较为适宜。

由以上分析可知，香菇菇柄经过酶A处理后，酶B进行酶解的最适工艺条件为pH 6.5，酶B添加量 0.15%，温度50 ℃，酶解6 h。此条件下，总氨基酸释放率为2.16%。

2.3  不同工艺的比较试验

对热水浸提法、纤维素酶酶解法、复合酶法3种方法释放香菇柄中呈味物质的效果进行了比较，结果见图10。由图10可知，游离氨基酸、呈味核苷酸和多糖的释放效果由高到低依次为复合酶法、纤维素酶单酶法和热水浸提法。复合酶法的氨基酸释放率较热水浸提法有大幅提高，复合酶的使用比单独加入纤维素酶效果更好，因为有蛋白酶参与作用，使胞内溶出的蛋白质加快分解，酶解液中氨基态氮含量得以显著提高，酶解液风味得到很大改善。复合酶法同时也大幅提高了多糖的溶出率，可能与纤维素酶的破壁作用有关。

2.4  酶解液感官判定分析

3种方法制备香菇柄酶解液感官评定结果如图11所示。从图11可看出，复合酶酶解液的感官效果最好，评定分数达到82分，其次是纤维素酶解液，而热水浸提液感官效果较差;感官评价结果与图10呈味物质比较结果吻合。

综合分析可知，利用复合酶中不同酶的作用特点进行分步酶解可以达到较好的酶解效果，复合酶法是3种释放香菇柄中风味成分综合效果最好的方法。

3  讨论

通过优化，得到香菇柄复合酶解的工艺条件为料液比1∶6，酶A添加量0.20%，最适pH 4.5，温度55 ℃，酶解2.0 h，然后调pH至6.5，加入酶B 0.15%，温度50 ℃，酶解6 h。此条件下，总氨基酸释放率为2.16%，呈味核苷酸释放率为1.57 %，多糖溶出率为7.25%;较热水浸提法和纤维素酶单酶法均有大幅提高。复合酶通过搭配使用，不仅可以提高酶解液中氨基酸等呈味物质的含量，而且改善了产品的感官风味，突出蛋白水解物的特征味[13]，且易与其他呈味成分配伍，赋予食品多层次、圆润味的特点[14]。香菇柄酶解之后仍有大量残渣产生，尚需寻求另一种香菇柄高效破壁技术与之协同使用。

参考文献：

[1] 朱丽云，吴俊清，吴丽樱，等.碱提香菇柄膳食纤维的功能性分析[J].中国食品学报，2013，13（4）：219-224.

[2] 史徳芳，周  明，郭  鹏，等.气流和机械碾轧超微粉碎香菇柄的效果比较[J].农业工程学报，2012，28（8）：280-286.

[3] CHEN H L， JU Y， LI JJ， et al. Antioxidant activities of polysaccharides from Lentinus edodes and their significance for disease prevention[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2012，50： 214-218.

[4] ZHANG Y Y， LI S， WANG X H， et al. advances in lentinan： Isolation， structure， chain conformation and bioactivities[J]. Food Hydrocolloids，2011，25（2）：196-206.

[5] ZHOU L D， ZHANG Q H， ZHANG Y， et al. The shiitake mushroom-derived immuno-stimulant lentinan protects against murine malaria blood-stage infection by evoking adaptive immune-responses[J]. International Immunopharmacology， 2009，9（4）：455-462.

[6] 高  虹，史德芳，何建军，等.超微粉碎对香菇柄功能成分和特性的影响[J].食品科学，2010，31（5）：40-43.

[7] 史德芳，高  虹，周  明，等.香菇柄多糖的微波辅助提取及其活性研究[J].食品研究与开发，2010，31（2）：10-14.

[8] 史德芳，高  虹，周  明，等.超微粉碎处理对香菇柄中多糖溶出率的影响[J].湖北农业科学，2009，48（7）：1730-1732.

[9] 高  虹，高章奎，史德芳，等.菌多糖纤维素及其制备方法[P].中国家专利：CN 200810237412，2012-04-11.

[10] 李  波，宋江良，赵  森，等.酶法提取香菇多糖工艺研究[J].食品科学，2007，28（9）：274-277.

[11] 吴关威，李  敏，黄  文，等.纤维素酶法提取香菇柄中呈昧核苷酸工艺研究[J]. 中国调味品，2010，12（35）：41-43.

[12] 吴关威.香菇柄中滋味成分释放研究及香菇精的研制[D].武汉：华中农业大学，2010.

[13] 秦  楠，郝  林.酶法香菇抽提物的营养及功能成分分析[J].农产品加工，2007（4）：80-82.

[14] YAMAGUCHI S. The synergist taste effect of monosodium glutamate and disodium 5-inosine[J]. Food Science，1967，32（12）：473-478.