李兵，何翠薇，陈青青，梁智

摘要：采用正交试验优化广西木薯（Manihot esculenta Crantz）叶中总黄酮提取的最佳工艺，并在此条件下提取木薯叶总黄酮进行抗菌性试验。结果表明，液料比1∶25（V∶m），乙醇体积分数60%，提取时间100 min的条件下木薯叶中总黄酮含量最高，达到25.23 mg/g;抗菌性试验表明，木薯叶总黄酮对金黄色葡萄球菌有较高的抑菌作用。

关键词：木薯（Manihot esculenta Crantz）叶;总黄酮;提取;抗菌

中图分类号：S533        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5816-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.049

木薯（Manihot esculenta Crantz）又叫树薯、木番薯，地下部结薯，属于大戟科木薯属植物[1]。木薯是中国主要的热带作物之一，已被确认为广西重要的非粮食能源作物，其种植面积迅速扩大，成为我国“十一五”重点发展的产业之一。然而，大规模的种植和加工利用产生大量的茎杆和叶等农副产品，它们没有得到充分利用而成为废弃物，这些废弃物往往被丢弃或是直接焚烧，既污染了环境，又浪费了资源。研究表明，食用木薯叶可提高抗病能力，减少患癌症及糖尿病、高血压等疾病的几率[2]。可见木薯除其块根部分外，其他没有充分利用的部分有可能含有有效的药用成分。研究发现，木薯叶中含有黄酮类化合物[3，4]，本研究采用正交试验法研究了广西木薯叶中黄酮类化合物的提取方法，同时进行了抗菌性研究，为进一步开发利用木薯叶提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

木薯叶采自广西桂北地区，经广西中医药大学郭敏副教授鉴定为大戟科（Euphorbiaceae）木薯属木薯（Manihot esculenta Crantz）的叶子，洗净后经50 ℃干燥48 h后粉碎备用。

1.2  试剂

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC26003，金黄色葡萄球菌耐药株（Staphylococcus susceptive strain），宋内氏痢疾杆菌（Shigella sonnei），绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853，以上菌株均由广西中医药大学微生物免疫学教研室提供;营养肉汤（批号20100821）、营养琼脂（批号201008131）、水解酪蛋白（MH）肉汤（批号201009022）均购自广东环凯微生物科技有限公司;芦丁对照品（批号100080-200707）购自中国药品生物制品检定所。

95%乙醇、H2SO4（批号T20090811）、二甲基亚砜（DMSO，批号T20100126）均购自国药集团化学试剂有限公司，BaCl2·2H2O（批号20071107）购自广州新建精细化工厂。

1.3  仪器与设备

SHZ-D型循环水式真空泵，KQ5200B型超声波清洗器，98-1-B型电子调温电热套立式压力蒸汽灭菌器，SW-CJ-1F超净工作台，BP211D型电子分析天平，游标卡尺（0～200 mm），Agilent 8453型紫外-可见分光光度计。

1.4  方法

1.4.1  木薯叶总黄酮标准曲线的绘制  精确称取120 ℃干燥至质量恒定的芦丁标准品5.7 mg，用60%乙醇溶液定容至10 mL，得到质量浓度0.57 mg/mL的标准品溶液。精确吸取上述标准品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL 60%乙醇溶液，加5% NaNO2溶液0.5 mL，摇匀放置6 min，再加10% Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min，加4% NaOH溶液4 mL，加60%乙醇溶液定容，摇匀放置15 min，在504 nm波长处测定吸光度A，绘制总黄酮质量浓度与吸光度的标准曲线[5-7]。

1.4.2  总黄酮提取的工艺流程  木薯叶碎叶→热浸提→过滤→提取液→浓缩→干燥→木薯叶总黄酮。

1.4.3  单因素试验  分别研究液料比（溶剂体积：原料质量，下同）、乙醇体积分数、提取时间对木薯叶总黄酮含量的影响。

总黄酮含量（mg/g）=■

式中，C表示质量浓度（mg/mL），v表示显色液的体积（mL），V表示乙醇的体积（mL），m表示所用木薯叶的质量（g）。

1.4.4  正交试验  根据单因素试验结果，确定以液料比（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）为试验因素，进行正交试验L9（34）（表1），优化木薯叶总黄酮的提取工艺。

1.4.5  验证试验  精确称取木薯叶粉末2.00 g，在正交试验所得最佳提取工艺条件下提取木薯叶总黄酮，计算总黄酮含量。

1.4.6  木薯叶总黄酮的抗菌性测定

1）培养基的制备：将营养琼脂33 g加入1 000 mL去离子水中，加热溶解并调节pH为7.4～7.6，于0.15 MPa下高压灭菌25 min。

2）菌液的制备：金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药株、宋内氏痢疾杆菌和绿脓杆菌使用前用接种环分别取新鲜菌苔接种于琼脂培养基中，置37 ℃恒温培养箱培养18 h，将经培养基传代的各菌种于试管壁上研磨并溶于2 mL灭菌注射用水中，配制成1×108 CFU/mL菌液备用。

3）抗菌性供试液制备：在优化工艺条件下提取的木薯叶总黄酮提取液，用乙酸乙酯萃取后浓缩制成稠膏，取木薯叶乙酸乙酯稠膏0.1 g，精确称量，用已灭菌注射用水溶解，加入适量灭菌二甲基亚砜（DMSO）助溶，配制成0.1 g/mL的木薯叶总黄酮乙酸乙酯萃取药液。

4）琼脂平板打孔法测定抗菌活性：于直径9 cm的无菌平皿内加入30 mL熔化的灭菌营养琼脂培养基，使其厚度约为0.5 cm，待其冷却凝固后作为底层;再取熔化的营养琼脂培养基15 mL，铺在底层之上，冷却凝固后作为上层。用直径为5 mm灭菌不锈钢打孔器在琼脂平板上均匀且垂直打5个孔。将100 μL供试验菌液均匀地涂布于琼脂平板的表面。用移液器吸取木薯叶总黄酮乙酸乙酯萃取药液约50 μL加入到各琼脂孔内，并用30 %二甲基亚砜（DMSO）无菌溶液作为空白对照，于37 ℃培养18～24 h。观察孔周围有无抑菌圈，并以游标卡尺测量抑菌圈两个垂直方向的直径（扣除孔径5 mm），取其平均值作为测定结果[8，9]。

2  结果与分析

2.1  木薯叶总黄酮标准曲线的绘制

在504 nm处，分别测出6 个标准溶液的吸光度，并对吸光度与黄酮质量浓度的关系作图，如图1所示，通过线性回归，得到方程为A=11.774×C+0.063 5，R2=0.987，其中A为吸光度，C为总黄酮的质量浓度。结果表明，在芦丁质量浓度为0.028 6～0.109 4 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2  单因素试验结果

2.2.1  液料比对木薯叶总黄酮含量的影响  在乙醇体积分数80%、提取时间60 min的条件下，研究液料比对木薯叶中总黄酮含量的影响。结果表明（图2），在1∶40范围内，随着溶剂量的增加，总黄酮含量明显升高。在实际操作中，考虑总黄酮的充分溶出同时也避免溶剂的浪费，正交试验设计中液料比设置为1∶10、1∶25、1∶40（mL∶g）。

2.2.2  乙醇体积分数对木薯叶总黄酮含量的影响在液料比1∶20、提取时间80 min条件下，研究乙醇体积分数对木薯叶中总黄酮含量的影响。结果表明（图3），当乙醇体积分数大于40%时，总黄酮含量随着乙醇体积分数的增大而升高，但乙醇体积分数太高提取的色素等杂质量也增加，故在正交试验设计中乙醇体积分数设置为40%、60%、80%。

2.2.3  提取时间对木薯叶总黄酮含量的影响  在乙醇体积分数60%、液料比1∶20条件下，研究提取时间30、40、80、100、120 min对木薯叶中总黄酮含量的影响。结果表明（图4），木薯叶黄酮提取率随提取时间的延长而升高，当提取时间大于100 min 后总黄酮含量开始下降。在选择提取时间时既要考虑有效物质是否充分溶出，也要注意过长时间的高温提取对化合物结构的影响，故正交试验设计中提取时间设置为40、70、100 min。

2.3  正交试验结果

从表2、3可以看出，影响木薯叶总黄酮含量的3个因素大小顺序为液料比、乙醇体积分数、提取时间，液料比对木薯叶总黄酮含量的影响较显著，乙醇体积分数、提取时间对木薯叶总黄酮含量的影响不大。得到的优化工艺参数为液料比1∶25，乙醇体积分数60%，提取时间100 min。

2.4  验证试验

为验证优选工艺的可靠性，取3份木薯叶碎叶，每份2.00 g，按上述最优工艺条件进行验证试验，测得总黄酮含量为25.23 mg/g，RSD为3.0%。

2.5  木薯叶总黄酮的抗菌性测定结果

木薯叶乙酸乙酯萃取部位抗菌试验结果见表4。由表4可见，木薯叶乙酸乙酯萃取药液对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药株均有明显的抑菌作用，对宋内氏痢疾杆菌、绿脓杆菌的生长亦有一定抑菌作用。4种菌种的抑菌圈直径分别为16.58、11.02、5.48、4.22 mm;抑菌效果为：金黄色葡萄球菌>金黄色葡萄球菌耐药株>宋内氏痢疾杆菌>绿脓杆菌，其中对金黄色葡萄球菌为高敏感。

3  结论

本试验以乙醇为溶剂，以广西木薯叶总黄酮含量为考察指标，通过对液料比、乙醇体积分数、回流时间进行单因素试验和正交试验，优选出广西木薯叶总黄酮的最佳提取工艺为液料比1∶25，乙醇体积分数60%，提取时间100 min。该工艺操作简便、成本低、收率高，具有良好的稳定性，可为广西木薯叶总黄酮的生产提供科学依据。

抗菌试验结果表明，木薯叶乙酸乙酯萃取药液对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药株、宋内氏痢疾杆菌、绿脓杆菌4种菌种均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最为明显，表明木薯叶乙酸乙酯萃取药液具有抑菌活性成分，以对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，可为进一步研究木薯叶的抑菌活性提供参考。

参考文献：

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999.

[2] 陶海腾，吕飞杰，台建祥，等.木薯叶营养保健功效的开发[J].中国农学通报，2008，24（6）：78-81.

[3] 何翠薇，陈玉萍，覃洁萍，等.木薯茎杆及叶化学成分初步研究[J].时珍国医国药，2011，22（4）：908-909.

[4] 何翠薇，覃洁萍，黄俏妮.HPLC法测定木薯叶中芦丁的含量[J].中国药房，2011，22（23）：2160-2161.

[5] 田春莲，蒋凤开.茜草总黄酮提取工艺研究[J].食品科学，2011，32（24）：60-63.

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[7] 刘  焱，付  玉，李  丽，等.正交试验法优选金樱子中总黄酮的提取工艺[J].广东农业科学，2013（2）：86-89.

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