周丹娜，夏菲，段正赢，刘学，郭锐，杨克礼，袁芳艳，刘泽文，孟丽，蔡行，田永祥

摘要：日本乙型脑炎（JE）是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的蚊媒性人畜共患病，造成人畜中枢神经系统损害，威胁人畜健康。JEV的非结构蛋白1（Nonstructural protein 1，NS1）是其重要的非结构蛋白，一方面可以诱导机体产生保护性免疫，另一方面参与病毒复制等多种生物学过程。试验采用化学融合法获得分泌乙型脑炎NS1蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系5D5，经检测获得的杂交瘤细胞系平均染色体数目约为90条，分泌的单抗为IgG1亚型，细胞上清效价为27。接种小鼠后，收取腹水，经辛酸-硫酸铵法进行纯化后，测得腹水效价为105。Western blot鉴定结果表明所制备单抗能够与JEV NS1蛋白特异性结合，具有良好的免疫反应性，可为JE诊断方法的建立以及NS1蛋白生物学功能的研究提供物质基础。

关键词：日本乙型脑炎;非结构蛋白1;单克隆抗体

中图分类号：S852.65        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5809-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.047

日本乙型脑炎（JE）是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的蚊媒性人畜共患病，造成人畜中枢神经系统损害，威胁人畜健康。JEV的非结构蛋白1（Nonstructural protein 1，NS1）是其重要的非结构蛋白，一方面可以诱导机体产生保护性免疫，另一方面参与病毒复制等多种生物学过程。试验采用化学融合法获得分泌乙型脑炎NS1蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系5D5，经检测获得的杂交瘤细胞系平均染色体数目约为90条，分泌的单抗为IgG1亚型，细胞上清效价为27。接种小鼠后，收取腹水，经辛酸-硫酸铵法进行纯化后，测得腹水效价为105。Western blot鉴定结果表明所制备单抗能够与JEV NS1蛋白特异性结合，具有良好的免疫反应性，可为JE诊断方法的建立以及NS1蛋白生物学功能的研究提供物质基础。

日本乙型脑炎病毒是目前世界流行性病毒性脑炎的最常见病原，年均感染约50 000人，其中约30%死亡[1]。乙型脑炎病毒基因组全长10 976 bp，分子质量在3 000 kD左右，单股正链RNA。JEV基因组由非编码区和单一开放读架（ORF）组成。ORF是含有10 296个碱基的中间片段，共编码10种蛋白，分别是核心蛋白、膜蛋白和囊膜蛋白这3种结构蛋白和NS1蛋白、NS2a蛋白、NS2b蛋白、NS3蛋白、NS4a蛋白、NS4b蛋白、NS5蛋白这7种非结构蛋白。NS1蛋白由415个氨基酸组成，胞外分泌，预测分子质量为40 kD左右。与其他非结构蛋白不同，NS1蛋白可以通过补体依赖性细胞融合作用杀死感染细胞，从而诱导机体产生非中和性的保护力，即在没有中和抗体的情况下就能诱导机体产生相应的保护力，并且没有抗体依赖性增强（ADE）作用[2]。此外，由于不同血清型或基因型的乙型脑炎毒株间NS1的基因和表型同源性很高，所以，可被用来做RT-PCR检测和研制具有广泛作用的亚单位疫苗[3]。除免疫保护性外，Mason等[4]通过E.coli将JEV抗原进行表达后证实了NS1蛋白在被JEV感染的细胞中有两种存在形式，分别是NS1和NS1′，它们含有同样的N末端，但是NS1′的C末端有一段由NS2a基因编码的高度疏水的氨基酸序列。NS1′的合成可能依赖于其二级结构，NS1′蛋白被证实是细胞凋亡过程中半胱天冬酶底物[5]。Lee等[6]认为NS1作为一种糖蛋白，在病毒复制的前期发挥作用，且可能与膜功能相关。因此，本研究在前期工作的基础上，拟以日本乙型脑炎病毒NS1为靶蛋白，制备单克隆抗体，不仅可以为深入研究NS1蛋白生物学功能提供研究工具，也为乙型脑炎病毒抗体/抗原检测方法的研发提供了物质基础条件。

1  材料与方法

1.1  材料

日本乙型脑炎病毒HW1株、SP2/0均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室保存;NS1-pET-28（a）质粒、NS1重组蛋白由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所构建及表达[7]。BALB/c小鼠购自湖北省疾病控制中心实验动物中心;JEV参考血清、TMD显色液和终止液购自武汉科前动物生物制品有限责任公司。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT干粉、HT干粉、8-氮鸟嘌呤、融合剂50%PEG4000、羊抗猪IgG-HRP、HPR-标记羊抗小鼠IgG、小牛血清白蛋白组分V（BSA）、秋水仙素购自Sigma公司;RPMI-1640、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司;二甲基亚砜（DMSO）、青、链霉素混合液（100×）（Gibco）、液体石蜡等购自碧云天生物技术有限公司;快速ELISA小鼠单克隆抗体分型试剂盒购自Thermo Scientific Pierce公司。

1.2  方法

1.2.1  NS1-iELISA试验  将重组表达的NS1重组蛋白纯化后溶于pH9.6的碳酸盐缓冲液中，从1∶20～1∶640做倍比稀释包被ELISA板，参考阴、阳性血清从1∶20～1∶160作倍比稀释进行方阵试验，选择最佳包被浓度和血清稀释倍数，初步建立iELISA抗体检测法。

操作步骤：将每孔100 μL包被液倍比稀释的 NS1蛋白包被酶标板，置于4 ℃过夜，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，用确定好的封闭液37 ℃封闭1 h，甩掉板孔中的溶液。酶标板用时，每孔加入100 μL稀释后的待检样品，轻轻振匀孔中样品，置37 ℃温育30 min。甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200 μL/孔，每次静置3 min倒掉，最后一次拍干。每孔加酶标二抗100 μL，轻轻摇匀置37 ℃温育30 min。甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200 μL/孔，每次静置3 min倒掉，最后一次拍干。每孔加底物液，室温避光显色10 min，加终止液，用酶标仪测定630 nm下的OD值。

挑选16份日本乙型脑炎抗体检测呈阴性的猪血清，按照上一步确定的试验条件进行ELISA，计算平均值（x），标准差（SD）;阴阳性临界值即为x+3SD。

1.2.2  单克隆抗体的制备及亚型鉴定  将NS1蛋白用PBS缓冲液稀释到400 μg/mL，与弗氏完全佐剂等体积充分混匀乳化，选择雌性4周龄BALB/c小鼠4只，腹腔注射0.2 mL/只，同时颈背部皮下多点注射0.2 mL/只。并于首免后第2周、第3周同剂量加强免疫。3免过后第7天断尾采血，用ELISA法检测抗体水平，选择免疫血清效价最高的BALB/c小鼠用NS1蛋白0.4 mL脾内冲击免疫一次，3 d后进行融合。取免疫小鼠脾细胞，并用50%聚乙二醇将其与SP2/0融合，通过上述建立的ELISA方法筛选杂交瘤细胞培养上清，将阳性的杂交瘤细胞按极限稀释法进行克隆。

采用亚型鉴定试剂盒，依据手册指示来鉴定单克隆抗体的亚型。

1.2.3  杂交瘤细胞染色体计数  将杂交瘤细胞传代后36～48 h处于对数生长期时加秋水仙素，使其终浓度为0.04 μg/mL，继续培养5 h;1 000 r/min离心10min，收集细胞;加入已37 ℃预温的0.075 mol/L的KCl低渗溶液5 mL，吹打细胞使其悬浮混匀，置于37 ℃水浴15～20 min;加入固定液1 mL，1 000 r/min离心10 min，弃上清液;加固定液5 mL，轻轻混匀，静置30 min，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，重复2次;加固定液5 mL，混匀，封管口，4 ℃过夜;1 000 r/min离心10 min，弃上清液，留下0.5 mL上清液，混匀，用滴管吸取细胞悬液自10～20 cm高处滴在4 ℃预冷的载玻片上，立即吹散，使细胞平铺其上，自然干燥;10% Giemsa染色10 min，用自来水洗去染液，自然干燥;选择染色体分散好、无重叠、无失散的细胞进行观察计数。每10个细胞的染色体数计数，计算平均值。

1.2.4  腹水的制备与纯化  选8周龄的BALB/c小鼠，灭菌液体石蜡腹腔注射0.5 mL/只;7 d后，将稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞按5.0×106个/只腹腔接种小鼠;10 d后抽取小鼠腹水，1 500 r/min离心10 min，收取上清液。采用辛酸-硫酸铵沉淀法对腹水上清进行纯化，去除杂蛋白，SDS-PAGE检测纯化效果，并用上述建立的ELISA方法检测纯化后腹水的效价。

1.2.5  NS1单抗的免疫印迹分析  收集被感染的日本乙型脑炎病毒细胞，通过SDS-PAGE分离，然后以350 mA电流作用1 h，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，再用含有1% BSA和5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20）封闭膜过夜，随后加入1∶500稀释的单抗37 ℃孵育1 h，用TBST缓冲液洗涤3次后，膜中加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗于37 ℃孵育1 h。依次用TBST缓冲液洗涤3次，TBS洗涤2次后，通过DAB显现蛋白带。

2  结果与分析

2.1  NS1-iELISA包被浓度、血清稀释倍数选择及临界值的判定

以纯化后的NS1重组蛋白（0.68 mg/mL）倍比稀释包被ELISA板，进行方阵滴定检测日本乙型脑炎病毒参考阴、阳性血清。方阵试验结果如表1、表2所示。由表1、表2可知，当抗原NS1蛋白40倍稀释，血清也以40倍稀释时，阳性血清OD630 nm值为1.085，阴性血清OD630 nm值为0.148，阳性值与阴性值差异较大，比值较高。因此，选定NS1蛋白最佳包被浓度为17 μg/mL，血清以40倍稀释。

根据16份JEV抗体阴性临床血清检测结果的OD630 nm，计算其平均值（x）、标准差（SD）、临界值（x+3SD），结果如表3所示。其临界值判定为0.317。

2.2  单克隆抗体制备及亚型鉴定

对小鼠免疫3次后第7天进行断尾采血，用上述NS1-iELISA方法进行血清效价检测，结果小鼠效价达到1∶6 400，加强免疫3 d后可进行融合。经过3次极限稀释法筛选获得一株杂交瘤细胞系5D5。将5D5的单抗细胞上清按2n进行稀释，经NS1- iELISA检测，单抗细胞上清效价为27，同时，设立pET-28（a）/BL21菌破碎上清液为包被物的ELISA试验作对照，结果显示单抗与BL21菌体蛋白无交叉反应。用单抗亚型鉴定试剂盒检测制备的单抗，结果显示，此单抗的亚型为IgG1。

2.3  杂交瘤细胞染色体计数

利用吉姆萨氏染色法对杂交瘤细胞的染色体进行染色，染色体形态如图1所示。计数结果显示，染色体数平均值为90条/细胞。

2.4  腹水的制备与纯化

收集的腹水采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行初步纯化，纯化前后均留样进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示。由图2可见，纯化后的单抗分别在50 kD左右和25 kD左右有明显的重链条带和轻链条带，大小正确。将纯化后的腹水用NS1-iELISA方法检测，效价为105。

2.5  Western blot鉴定分析

免疫印迹分析试验结果（图3）显示，NS1单抗5D5可与JEV蛋白产生特异性的免疫反应，且有两条反应条带。

3  小结与讨论

在本研究中，纯化的重组表达NS1蛋白用来接种免疫小鼠生产单抗。通过ELISA试验筛选杂交瘤细胞培养上清液，生成NS1蛋白单克隆抗体1株。通过免疫印迹分析试验证实所获单克隆抗体具有较高的特异性。

本研究免疫小鼠的抗原是采用原核表达的NS1蛋白经镍柱纯化与弗氏佐剂混合乳化后所得，免疫小鼠后，会同时产生针对NS1蛋白、HIS标签蛋白或残留的BL21菌体蛋白的抗体，可能会对筛选造成干扰。因此，本研究在筛选单抗时，有设立将pET-28（a）/BL21破碎后的蛋白溶液包被作对照，以保证所筛选出单抗的特异性。

大量生产单抗主要有细胞培养法和小鼠腹水法。小鼠腹水法虽然有可能会受到鼠源性杂质的干扰，但其具有腹水生产速度快（一般只需7～10 d）且产量高、腹水较易纯化等优点，因此，本试验大量生产单抗采用腹水法。本试验采用弗氏不完全佐剂腹腔注射致敏小鼠，1周后，再腹腔注射所筛选出杂交瘤细胞。因为注射细胞量太少会导致腹水生产时间太长，而细胞量太多则可能形成实体瘤。本研究细胞注射量为5.0×106个/只，注射过程中注意缓慢推入。本试验在收集腹水时，未见小鼠形成实体瘤，均有收集到腹水。

陈丹等[8]分别采用辛酸法、硫酸铵法与辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体，对这3种方法纯化抗体的效果进行了比较，结果显示单独采用辛酸法或硫酸铵法纯化效果较差，而辛酸-硫酸铵沉淀法纯化效果较好。本试验所收集小鼠腹水采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行初步分离纯化，该方法成本低廉，操作较为简单，且初步纯化效果较好。经此方法纯化后，已除去单克隆抗体中的大部分杂蛋白。

综上所述，本研究制备了抗NS1单克隆抗体并定性。该单克隆抗体可以作为研究日本乙型脑炎免疫机理、病毒复制机制的有效工具，并为进一步研究日本乙型脑炎病毒的发病机制打下了基础。

参考文献：

[1] SOLOMO T， NI H， BEASLEY D W， et al. Origin and evolution of Japanese encephalitis virus in Southeast Asia[J]. J Virol， 2003， 77（5）： 3091-3098.

[2] 臧富玉，亓文宝，陈孝明，等.日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1-Flag蛋白在293T细胞中的表达[J].中国畜牧兽医， 2011，38（9）：40-43.

[3] 王  祥，陈焕春.JEV分子生物学与新型疫苗研究进展[J].动物医学进展，2001，22（3）：5-10.

[4] MASON P W， DALRYMPLE J M， GENTRY M K，et al. MolecμLar characterization of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structural glycoprotein[J]. J Gen Virol， 1989， 70： 2037-2049.

[5] SUN J， YU Y， DEUBEL V. Japanese encephalitis virus NS1′protein depends on pseudoknot secondary structure and is cleaved by caspase during virus infection and cell apoptosis[J]. Microbes Infect. 2012， 14： 930-940.

[6] LEE E， FERNON C， SIMPSON R， et al. Sequence of the 3′half of the murray valley encephalitis virus genome and mapping of the nonstructural proteins NS1， NS3 and NS5[J]. Virus Genes，1990，4（3）：197-213.

[7] 周丹娜，梁望旺，郭  锐，等.重组日本乙型脑炎病毒NS1的可溶性表达及抗原性分析[J].湖北农业科学，2012，51（2）：358-360.

[8] 陈  丹，孙广瑞，柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用[J].安徽农业科学，2007，35（26）：8105，8108.