吴金平，矫振彪，陈磊夫，焦忠久，邱正明

摘要：魔芋（Amorphophallus Konjac）软腐病频发已成为制约魔芋种植业发展的瓶颈。目前对其病原、发病规律及防治方法等进行了一些研究，加深了对魔芋软腐病的认识，取得了一定进展，但对魔芋软腐病的侵染和发病机制缺乏系统而深入的研究。通过测定软腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）在魔芋根表吸附量和根部侵入量，研究不同温度、pH、接种浓度、LPS和EPS对软腐菌在魔芋苗根部吸附和侵入过程的影响。结果表明，软腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的最适温度条件是30 ℃、pH 6.0，随接种浓度增加吸附和侵入量增加;菌体LPS是魔芋软腐欧文氏菌对寄主根表的吸附所不可缺少的成分，而EPS预处理对吸附侵入量影响较小。本研究明确不同外界因子（温度、pH、接种浓度）和细菌识别子（EPS和LPS）在软腐菌吸附识别魔芋根际中的作用，从源头上了解软腐菌对魔芋根系的侵染机制，为研究病害循环和制订防治策略提供新的启示，从根本上有效控制魔芋病害的发生，并为魔芋的抗病育种提供新思路。

关键词：魔芋（Amorphophallus Konjac）;软腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）;吸附;侵入

中图分类号：S792.39        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5734-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.027

魔芋（Amorphophallus Konjac）是自然界中唯一高含葡甘聚糖的特种经济作物，其在食品、医药保健、工业材料等方面用途广泛[1]。随着加工产业的快速壮大，其种植面积也迅速扩大，据2013年中国魔芋产业发展研讨会统计，2013年全国魔芋种植面积已达 169.31 万亩。但在魔芋种植过程中，魔芋软腐病病原为软腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora），一般减产20%～30%，严重的达80%，甚至绝收[2]。

自二十世纪八十年代发现魔芋软腐病以来，对其病原、发病规律及防治方法等进行了一些研究，加深了对软腐病的认识，取得了一定进展，但对魔芋软腐病的侵染和发病机制缺乏系统而深入的研究。很多学者根据软腐病菌的侵染特性，认为魔芋软腐病病原菌是从自然孔口和伤口侵入。Wu等[3]研究发现，在魔芋软腐病系统中，软腐菌可以通过魔芋根系的吸附侵入，导致病害的发生。

病原细菌与寄主植物在根系的相互作用包括一系列的连续反应，由接触、吸附到定殖及其间的相互识别，然后侵人并潜伏，最后导致寄主发病[4]。因此，研究软腐病如何识别、吸附、侵染根系的机理，对确定生产中防治重点有重要意义。

1  材料与方法

1.1  材料

Pectobacterium carotovora subsp.carotovora为湖北省农业科学院经济作物研究所实验室保存（Genbank注册号FJ463871）。魔芋组培苗由湖北省农业科学院经济作物研究所实验室提供，高度6～8 cm，生根15～20 d，根长约2 cm。

1.2  试验方法

1.2.1  菌种制备  将供试菌株在NA培养基30 ℃培养24 h，用无菌水配制成细菌悬浮液，稀释平板计数，备用。

1.2.2  不同温度条件下软腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量测定 取配好的浓度为6×107个/mL细菌悬浮液50 mL装入250 mL培养瓶中，分别置于15、20、25、30、35℃的光照培养箱内，待菌悬液的温度与培养箱内温度一致后，将魔芋苗放入其中，根部完全浸没到悬浮液中，每组处理3棵魔芋苗，在浸根接种后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分别剪取幼根，测定不同温度条件下软腐菌根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。

1.2.3  不同pH条件下软腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量测定  用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将无菌水pH调节为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分别配制成浓度为6×107个/mL的细菌悬浮液，然后取50 mL相应值的细菌悬浮液放入250 mL培养瓶中，将魔芋苗放入其中，根部完全浸没到悬浮液中，每组处理3棵魔芋苗，置于30 ℃的光照培养箱内，在浸根接种后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分别剪取幼根，测定不同pH条件下软腐菌根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。

1.2.4  不同接种浓度下软腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量测定  用无菌水分别配制浓度为6×104、6×105、6×106、6×107、6×108个/mL的细菌悬浮液，取50 mL相应值的细菌悬浮液放入250 mL培养瓶中，将魔芋苗放入其中，根部完全浸没到悬浮液中，每个处理3棵魔芋苗，置于30 ℃的光照培养箱内，在浸根接种后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分别剪取幼根，测定不同接种浓度条件下软腐菌根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。

1.2.5  LPS和EPS的吸附和抑制试验  取6×108个/mL浓度细菌悬浮液1 mL加入1 000 mL NA液体培养基，在30 ℃，200 r/min条件下培养18 h，按Baker 等的酚水法提取LPS[5]。按Husain酒精沉淀法提取EPS[6]。参照董汉松等[7]的方法，用LPS和EPS分别对幼苗进行浸根处理，以无菌水作为对照，30 ℃条件下，30 min 后用pH 7.0细菌悬浮液（6×108个/mL） 接种，以不做预处理的接种为对照。30 ℃ 测定幼苗接种1 h 和6 h 后软腐菌对根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。

1.2.6  EPS和LPS对菌体的吸附和抑制试验  无EPS和无EPS及LPS菌体悬浮液制备参考董汉松等[7]的方法。分别用浓度为6×108个/mL无EPS及无EPS及LPS的细菌悬浮液处理魔芋苗，以未处理6×108个/mL的细菌悬浮液处理魔芋苗。30 ℃ 测定幼苗接种1 h 和6 h 后软腐菌对根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。

1.2.7  根表吸附量和根部侵入量测定方法及根表吸附量测定[8]  每株每次剪取1条幼根，距离幼根末端约2 cm，将截取的根尖浸入5 mL无菌水中，涤荡1 min后，取出根尖，用灭菌滤纸吸干外表水分，称质量，用稀释平板法统计悬浮液中的细菌数量，即为软腐菌的根表吸附量。根部侵入量测定[8]：将称重后的根尖放入5 mL无菌水中，磨碎，用平板计数法计数悬浮液中的细菌数量，即为软腐菌的根部侵入量，计算公式为：吸附或侵入量（个/g鲜质量）=细菌浓度（个/mL）×分离用水量（mL）/根质量（g鲜质量）。

2  结果与分析

2.1  温度对软腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影响

由图1和图2可知，在整个温度梯度中，随温度升高，根部吸附侵入量逐渐增高，当温度升至30 ℃时，根部吸附和侵入量最高，35 ℃时根部吸附和侵入量逐渐降低，这可能因为软腐菌的最适生长温度为28 ℃，高温抑制了病菌的生长，所以根部吸附侵入量降低。在所有温度梯度范围内，菌株的吸附侵入量都随时间的延长呈上升趋势。方差分析表明，不同温度下软腐菌在魔芋根部吸附侵入有极显著差异（P<0.01）。

2.2  pH对软腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影响

从图3和图4可以看出，pH 6.0时，魔芋苗根部吸附侵入软腐病病量均最高，这可能是因为魔芋软腐菌最适生长pH为6.0～6.5。对在不同pH条件下的魔芋苗根部吸附侵入软腐病病量进行方差分析，结果表明，不同pH值条件下菌株在魔芋根部吸附侵入软腐病量都具有极显著影响（P=0.0001<0.01）。

2.3  不同接种浓度对软腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影响

不同接种浓度条件下软腐菌在魔芋苗根部吸附侵入量由图5和图6可知，随着接种浓度的增加，软腐菌吸附侵入量也增加，对菌株在不同接种浓度时的根部吸附侵入量进行方差分析，结果表明，不同接种浓度下软腐菌在魔芋根部吸附侵入量具有极显著差异（P=0.0001<0.01）。

2.4  软腐病菌LPS和EPS对病菌的吸附抑制效应

LPS和EPS预处理魔芋根系对随后接种菌吸附侵入量的影响如表1所示，LPS对软腐菌的根表吸附和根部侵入都有一定的抑制作用，使其根表吸附量和根部侵入量都有不同程度的下降;但EPS对寄主根系预处理后，对接种菌并无明显的吸附抑制或增强效应。

2.5  洗去EPS及洗去EPS和LPS的菌体对魔芋根部的吸附侵入量

从表2可以看出，洗去EPS/LPS的软腐菌菌体对魔芋根部的吸附侵入量比洗去EPS高，洗去EPS/LPS和洗去 EPS的软腐菌菌体对魔芋根部的吸附侵入量比菌液处理的低。

3  小结与讨论

软腐菌体对魔芋根部的吸附侵入量随时间的延长菌量增加，本试验只做了6 h，主要是因为软腐菌致病力很强，而实验材料为幼嫩的魔芋组培苗根部，8 h根部感觉有软腐症状了，12 h整个根部软腐。

软腐菌体对魔芋根部的吸附侵入量的最适温度为30 ℃，最适pH 6.0，这和魔芋软腐病菌的生物学特性一致[9]。在其生长最适条件下，吸附侵入能力最强。因此，在软腐病综合防治中，利用高山气候或者遮阴作为套种，降低温度，通过调节种植地土壤pH，可以有效减慢软腐病菌的侵染速度，减轻病害危害。但随着时间的推移，魔芋的根系可对病菌发生富集作用，使病菌种群数量增高而达到侵人所需的量。由于根系的富集作用，软腐菌随时间的延长菌量增加而达到侵入所需的量[10]。因此，以上综合防治只能延缓病害的发生，并不能解决病害问题。

通过LPS和EPS预处理魔芋根系对随后接种菌吸附侵入量的影响研究可以看出，用LPS处理吸附侵入量都有所降低，而EPS预处理对吸附侵入量影响较小，菌体LPS是魔芋软腐欧文氏菌对寄主根表的吸附所不可缺少的成分。鉴于LPS在软腐病菌体接触识别魔芋根系所表现出来的抑制作用，以从化合物直接利用和基因工程菌株利用途径进行软腐病防治，如可借分子遗传学方法把接触识别改造为病害控制所用，或获得病菌吸附缺陷型工程菌株，病菌LPS作为congon的作用，从理论上讲，一旦施于根表生态，可以占据识别位点而阻止病菌侵人，但这取决于在根表的分布特性、产生和施用技术及经济效益等多因素。

通过本研究，明确不同外界因子（温度、pH、接种浓度）和细菌识别因子（EPS和LPS）在软腐菌吸附识别魔芋根际中的作用，从源头上了解软腐菌对魔芋根系的侵染机制，为研究病害循环和制订防治策略提供新的启示，为有效控制魔芋病害的发生和魔芋的抗病育种提供新思路。

参考文献：

[1] 史丽英.魔芋葡甘聚糖的研究利用[J].河南科技，2013（14）： 53-57.

[2] 彭金波，费甫华，廖文月，等.魔芋连作田病害高发原因及防治对策[J].植物医生，2007，20（2）：14.

[3] WU J P， DIAO Y， GU Y C， et al. Infection Pathways of Soft Rot Pathogens on Amorphophallus konjac.African Journal of Microbiology Research[J]， 2010， 4（14）： 1495-1499.

[4] GEOFFREY C A. Introduction to the history of plant pathology[M]. Gambridge：Gambridge Univ. Press， 2009. 299-324.

[5] BACKER C J， NEILSON M J， SEQUEIRA L. Chemical characterization of the lipopolysacch aride of Pseudomonas solanacearum[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1984， 47（5）：1096-1100.

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[7] 董汉松，王金生，方中达.菌体脂多糖在大白菜软腐欧文式菌对寄主跟表吸附中的作用[J].微生物学报，1993，33（2）：144-150.

[8] 王  军，韦爱梅，孙  思.青枯菌对桉树及非寄主树木根部吸附和侵入的比较[J].林业科学，2007，43（7）：51-54.

[9] 黄俊斌，邱仁胜，赵纯森，等.魔芋软腐病病原菌的鉴定及生物学特性初步研究[J].华中农业大学学报，1999，18（5）：413-415.

[10] LOUIS G， C？魪CILE G， RICHARD C，et al. Elevation of three subspecies of Pectobacterium carotovorum to species level： Pectobacterium atrosepticum sp. nov.， Pectobacterium betavasculorum sp. nov. and Pectobacterium wasabiae sp. nov[J]. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003， 53： 381-391.