查中萍，万丙良，杜雪树，殷得所，戚华雄

摘要：对海洋硅藻硝酸盐转运蛋白NAT3编码基因的单拷贝插入转基因水稻纯系进行荧光定量PCR检测，获得NAT3基因的超表达株系。NAT3超表达株系中硝酸还原酶基因OsNR1的转录较非转基因对照中花11显著增强。对超表达株系及对照中花11进行不同氮素浓度的培养和栽培试验。结果表明，在低氮培养基培养条件下，转NAT3基因水稻的幼苗干重较中花11高;在低氮盆栽条件下，转NAT3基因超表达株系的叶绿素含量、生物学产量和植株的含氮量均较相同氮素条件下的中花11高，说明NAT3基因超表达能提高转基因水稻在低氮条件下的氮素利用效率，促进水稻生长。

关键词：转基因水稻;硝酸盐转运蛋白;氮素利用效率

中图分类号：S511        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5653-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.009

水稻是我国主要的粮食作物，种植面积占粮食作物总面积的27%，产量占粮食总产的44%[1]。长期以来，水稻育种多以高产、耐肥抗倒作为主要育种目标，因为追求高产导致氮肥施用量大幅度增加[2]。大量氮肥的使用不仅提高了水稻的种植成本，导致增产不增收，而且还带来水体硝酸盐污染的潜在危险，对生态环境和人类健康产生极为不利的影响[3]。由于氮肥利用率的下降，氮肥过量施用造成的环境负效应也越来越引起广泛关注[4-8]。因此，通过遗传改良提高水稻品种的氮素吸收利用能力，降低氮肥使用量是发展水稻生产急需解决的重要问题。

水稻根系对土壤中氮素的吸收是决定水稻氮素利用效率的前提。硝酸盐是植物可直接利用的主要氮源之一，植物对硝酸盐的吸收主要依靠硝酸盐转运蛋白完成。深海硅藻硝酸盐转运蛋白基因与氮具有高度亲和性，在低氮环境下转录水平显著升高，可使硅藻从硝酸盐浓度极低的海水中富集硝酸盐[9]。NAT3是刘昱辉等[10]从深海硅藻中克隆的一个硝酸盐转运蛋白基因，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将NAT3基因导入水稻品种中花11，获得了NAT3基因的转基因植株[11]。本研究通过荧光定量PCR对转基因水稻中NAT3基因表达量进行分析，获得NAT3基因超表达纯系，并进一步通过不同氮浓度的培养基培养及盆栽试验，测定转基因水稻与对照受体材料中花11的生长量及植株含氮量，并分析NAT3基因的表达对转基因水稻的氮素利用率的影响，为应用转基因技术培育氮肥高效利用水稻提供理论依据。本研究对减少水稻生产中的氮肥施用量、节约水稻生产成本、降低环境污染、促进农业高效节能可持续发展具有重要意义。

1  材料与方法

1.1  试验材料

本试验转基因株系是以中花11为受体的转NAT3基因T4代单拷贝插入纯系[11]。非转基因水稻对照材料为中花11，由湖北省粮食作物种质创新与遗传改良重点实验室繁殖保存。

1.2  NAT3基因及硝酸还原酶基因OsNR1表达量的测定

取三叶一心期的水稻幼苗（包括根），利用Trizol试剂抽提总RNA，通过琼脂糖凝胶和紫外分光光度计测定RNA质量和浓度。取5 μg RNA反转录酶合成单链cDNA，采用Roche公司的定量检测试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master （Rox）进行定量PCR分析，内标基因为actin基因。引物由Invitrogen中国公司合成。扩增体系25 μL，其中12.5 μL 2× qPCR Mix ，2.0 μL引物，2.5 μL反转录产物，8.0 μL ddH2O 。扩增程序为预变性95 ℃，10 min;95 ℃变性15 s， 58 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸20 s， 40 次循环;72 ℃延伸5 min。采用ΔΔCT法进行结果处理。

1.3  不同氮浓度培养基上转NAT3基因水稻幼苗的生长状况测定

NAT3基因超表达株系及对照中花11的成熟胚经消毒后，于MS培养基上获得无菌苗，选取生长状况一致的幼苗，去除胚乳后移栽到1/2MS、1/4MS、1/8MS 3个不同氮浓度的培养基上（1/2MS、1/4MS、1/8MS表示MS培养基中大量元素中的氮素减半，其余成分不变）。每个处理种植5株，40 d后取样，测定各处理5个植株的整株干重。

1.4  转NAT3基因水稻盆栽试验

盆栽基土为含氮量低的黄棕壤，碱解氮含量74.57 mg/kg。晒干后称取8 kg/（盆·干土），分别按不同氮素处理加入相应的营养元素。盆栽试验氮肥处理浓度设计如表1所示，在施用相同磷、钾肥的基础上，设4个氮素处理，分别为全氮（1N）、1/3氮（1/3N）、1/6氮（1/6N）、不施N肥（0N，空白对照），分基肥、分蘖肥和抽穗肥三期施用。NAT3基因超表达株系及对照中花11种子在育秧盘中播种，至四叶一心时选取生长一致的幼苗移栽，每盆种植4株，每个氮素处理种植6盆。抽穗期取3盆植株进行叶片叶绿素含量。成熟后另外3盆收获整个植株（包括根系），烘干后测定生物学产量和含氮量。

1.5  叶绿素含量测定

抽穗期取倒二叶片，每个处理取3个叶片，每个叶片测定2次。参考文献[12]测定叶绿素含量。

1.6  水稻植株含氮量及生物学产量测定

收获转基因株系及对照水稻整个植株（包括根系），洗净烘干后称重待测。用凯氏定氮法测定植株含氮量。

2  结果与分析

2.1  转基因株系中NAT3基因及硝酸还原酶基因OsNR1的表达

不同转基因株系中NAT3和OsNR1基因的转录表达情况如图1所示。10个转基因株系中有8个株系的NAT3基因有不同程度的转录表达，其中T4-1、T4-2及T4-3的NAT3基因转录量较高，而株系T4-9、T4-10及非转基因对照中花11中无NAT3基因转录。OsNR1基因在株系T4-1、T4-2及T4-3中有较高的表达量，高于在其他转基因株系与中花11中的表达量。OsNR1基因在不同转基因株系中的表达趋势与NAT3基因的表达趋势基本一致。同中花11相比，株系T4-1、T4-2及T4-3中OsNR1的转录显著增强。结果说明，NAT3基因整合到水稻基因组中后，能够正常表达，而且其超表达促进了下游硝酸还原酶OsNR1基因的表达。选择NAT3和OsNR1基因表达量高的转基因株系T4-1、T4-2及T4-3进行后续试验研究。

2.2  不同氮浓度培养基上NAT3基因超表达株系幼苗的生长状况

在不同氮浓度培养基上生长的转基因株系T4-1、T4-2、T4-3及对照中花11幼苗的干重结果如表2所示。由表2可知，在1/2MS、1/4MS、1/8MS 3种氮浓度培养基上，3个转基因株系40 d龄幼苗的干重均高于非转基因对照中花11的幼苗干重，其中在1/4MS和1/8MS培养基上转基因株系的幼苗干重与对照之间的差异达极显著水平（P<0.01）。结果表明，同对照相比，转基因水稻幼苗在低氮环境下的生长速度快于非转基因对照。

2.3  NAT3基因超表达水稻叶绿素含量分析

不同氮素营养条件下，转基因株系及非转基因对照中花11抽穗期倒二叶叶绿素含量如表3所示。由表3可知，随着氮素使用量的降低，NAT3基因超表达株系及中花11的叶片叶绿素a和叶绿素b含量均有不同程度的下降;在1/3N、1/6N及0N处理条件下，转基因株系叶绿素a含量较对照中花11高，但无显著差异（P<0.05）;T4-3在1/3N、1/6N和0N的低氮条件下的叶绿素b含量均显著（P<0.05）高于对照中花11。结果表明，在低氮环境下NAT3基因超表达株系叶绿素含量较对照有所增加，其中株系T4-3中叶绿素b含量显著高于非转基因对照。

2.4  NAT3基因超表达水稻植株含氮量及生物学产量

不同氮素营养条件下，NAT3基因超表达株系和非转基因对照中花11的含氮量和生物学产量结果如表4所示。由表4可知，转基因株系在1/3N、1/6N的条件下，其植株的生物学产量和含氮量均高于对照，其中T4-1株系在1/3N、1/6N的低氮条件下，其生物学产量和含氮量较对照的差异均达显著水平（P<0.05）;T4-3株系在1/3N、1/6N低氮条件下的生物学产量较对照的差异达极显著水平（P<0.01）。说明NAT3基因的超表达能提高水稻对氮肥的利用效率，提高植株含氮量和生物学产量。

3  小结与讨论

硝态氮（NO3-）是植物吸收利用的主要氮源之一。硝酸盐转运蛋白是植物硝酸盐转运系统的重要组成部分，分为低亲和性和高亲和性两类。大量研究已经证明，高亲和性硝酸盐转运系统主要负责低NO3-浓度时植物氮的吸收[13-15]。硝酸盐转运蛋白基因NRT2.1缺失突变的拟南芥丧失75%的高亲和性硝酸盐转运系统活性[16，17]，因此导致在以NO3-为惟一氮源的低氮环境下不能正常生长[18]。然而通过在植物中超表达高亲和性硝酸盐转运蛋白基因改变植物的氮素利用效率的研究鲜有。Fraisier等[19]在烟草中超表达高亲和性硝酸盐转运蛋白基因NpNRT2.1，结果表明，不论环境中提供的NO3-浓度水平如何，转基因烟草和野生型对照中的NO3-含量无显著差异。

本研究中，NAT3基因在水稻中超表达后，促进了硝酸还原酶OsNR1基因的表达。在低氮条件下，转基因植株的含氮量较非转基因对照高，表明NAT3基因的超表达在低氮环境下促进了氮的吸收。在正常氮水平条件下，NAT3基因的超表达并不能促进氮的吸收。这是因为NAT3属于高亲和性的硝酸盐转运系统，转录后调控使其主要在低氮环境下起作用[20]。同转NAT3基因水稻在低氮环境下的氮素吸收效率增强一致，在低氮环境下转NAT3基因水稻的生物学产量和叶片叶绿素含量较非转基因对照均有所提高。但转NAT3基因水稻在低氮环境下的氮素含量、叶片叶绿素含量和生物学产量均低于正常环境下的相应指标，说明，转NAT3基因水稻在低氮环境下的氮素吸收效率虽然有所提高，但在本试验所设置的低氮条件下仍未达到满足水稻正常生长发育所需的水平。

中国的水稻氮肥施用量占全球水稻氮肥施用量的37%，氮肥利用率远远低于全球的平均水平[21]。过量施用氮肥导致环境污染，也增加了农民的水稻种植成本。本研究获得的硝酸盐转运蛋白NAT3转基因水稻在低氮环境下的氮素吸收效率高于非转基因对照，为利用生物技术提高水稻的氮素利用效率、减少氮肥的过量使用提供了有效的技术途径。

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