张龙锋，邱 敏，蒋丽军，刘 强，焦志军，吴稚伟△

（1.江苏大学附属医院检验科，江苏镇江 212001；2.南京大学医学院，南京 210008；3.扬州市第一人民医院儿科，江苏扬州 225001）

4－苯乙烯磺酸马来酸酐共聚物抑制HIV-1的初步研究＊

张龙锋1，邱 敏2，蒋丽军3，刘 强1，焦志军1，吴稚伟2△

（1.江苏大学附属医院检验科，江苏镇江 212001；2.南京大学医学院，南京 210008；3.扬州市第一人民医院儿科，江苏扬州 225001）

目的研究4-苯乙烯磺酸马来酸酐共聚物（PSM）对HIV-1的抑制作用。方法通过Luciferase检测不同浓度的PSM对易感细胞GHOST（3）X4／Hi5中HIV-1的抑制作用，观察PSM对北美HIV-1毒株JR-FL、HXB2和中国临床分离株CNE6、CNE30、CNE50和CNE55的抑制作用；利用CCK8试剂盒测定PSM对VK2／E6E7生长的抑制率来观察PSM的体外细胞毒性。通过逆转录荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测生殖道上皮细胞 HEC-1-A的紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin和Occludin的表达，观察PSM对生殖道上皮细胞HEC-1-A表达的紧密连接蛋白的影响从而间接评价其对局部黏膜完整性的影响。结果PSM对北美HIV-1毒株JR-FL、HXB2以及中国常见临床分离株CNE6、CNE30、CNE50和CNE55的抑制EC50分别为5.78、0.77、1.85、3.15、1.70和2.27μg／mL，具有抗 HIV-1感染的活性；PSM 对 VK2／E6E7细胞具有低毒性；PSM 不明显抑制 ZO-1的表达且增加了E-cadherin和Occludin的转录水平。结论PSM可以抑制HIV-1感染，具有作为杀微生物剂的潜能。

4-苯乙烯磺酸马来酸酐共聚物；抗病毒；HIV-1

自从1981年发现第一例艾滋病以来，全世界每天有约15 000新增感染者［1］。截止2014年2月，我国官方报告现有HIV感染者40多万［2］。传播途径中性传播占有非常重要的位置，最近的研究显示，超过90%的新近感染者是通过无防护的性交产生的。女性在无防护性交过程中较男性更容易感染HIV以及其他生殖道性病，所以研究开发女性可控的局部杀微生物剂具有十分重要的意义［3－7］。过去几年有较多的抗HIV的药物研究和报道［1，3－7］，但是目前仍没有理想的局部杀微生物剂的问世，所以研究开发预防性药物－局部杀微生物剂具有十分重要的意义。目前发现苯乙烯磺酸钠及其共聚化合物4-苯乙烯磺酸马来酸酐共聚物 （4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid，PSM）具有阻断性传播疾病的作用［7－8］。本文初步研究了PSM抗人类免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）的活性及其生物安全性。

1 材料与方法

1.1 材料 PSM购于Sigma公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；qRT-PCR试剂购自日本TOYOBO公司；荧光素酶（Luciferase）检测试剂盒购自美国Promega公司；转染试剂Lipofectamine-2000购自美国Invitrogen公司；HEC-293T、VK2／E6E7细胞购于美国ATCC。GHOST（3）X4／Hi5来源于美国NIH AIDS Research and Reference Reagent Program；HIV-1／VSV-G假病毒，质粒 pNL4-3E-R-Luc来自清华大学张林琦教授。HIV-1假病毒的构建参照Connor等［9］和 He等［10］的方法进行。将293T细胞接种于10cm的培养皿中，待细胞密度达到90%以上时，利用聚乙二醇 （PEG）将pNL4-3 E-R-Luc和Env质粒按照2∶1的比例转染细胞，转染后16h换液。转染48h后，收集上清液，分装冻存于－80℃环境。将病毒液进行10倍梯度稀释，接种于生长在96孔板中的GHOST（3）X4／Hi5细胞中，48h后利用Promega Luminometer检测Luciferase活性来确定病毒滴度。病毒的滴度用半数组织培养感染量（50%tissue culture infective dose，TCID50）表示［11－12］。

1.2 方法

1.2.1 PSM抗HIV-1感染的活性检测 将PSM进行梯度稀释，加入到96孔板中。将病毒液稀释到4 000TCID 50／mL，每孔加入50μL，放置于37℃孵育1h。孵育完毕后，在每孔中接种104个GHOST（3）X4／Hi5细胞，于37℃，5%CO2培养。培养48h后，弃去培养基，加入100μL Promega Glo-Lysis buffer进行裂解。再取一空白96孔板，每个相应孔加入50 μL细胞裂解液随后加入50μL Luciferase底物，然后迅速混匀，立即用Promega Luminometer测定Luciferase活性，计算病毒感染率。利用HIV-1假病毒感染系统来观察PSM对试验毒株（北美HIV-1毒株R5型JR-FL和X4型HXB2和中国临床分离株CNE6、CNE30、CNE50和CNE55）的抗病毒活性。

1.2.2 PSM的细胞毒性实验 将VK2／E6E7或GHOST（3）X4／Hi5细胞分别接种于96孔板中，每孔细胞数约为104个，于37℃，5%CO2培养24h。将PSM进行梯度稀释，取每种浓度的PSM 50μL加入到各孔中。继续培养48h后，每孔加入10μL的CCK8工作液，于37℃，5%CO2孵育2～4h，于450nm处测定每孔的吸光值，计算药物对细胞生长的抑制率。

1.2.3 HEC-1-A紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin和 Occludin的RNA抽提和qRT-PCR的检测 按照试剂说明书进行RNA的提取和逆转录并进行检测。使用Life Technology的SYBR Green Mix进行qRT-PCR检测，其中使用的PCR引物如下，ZO-1上游引物为：5′-AAG TCA CAC TGG TGA AAT CC-3′，下游引物为：5′-CTC TTG CTG CCA AAC TAT CT-3′，产 物 大 小 102bp；E-cadherin上 游 引 物 为：5′-AGG CCA AGC AGC AGT ACA TT-3′，下游引物为：5′-ATT CAC ATC CAG CAC ATC CA-3′，产物大小110bp；Occludin上游引物为：5′-CAT TGC CAT CTT TGC CTG TG-3′，下游引物为：5′-AGC CAT AAC CAT AGC CAT AGC-3′，产物大小149bp；GAPDH 上游引物为：5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′，下游引物为：5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-5′，产物大小87bp。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PSM具有抗HIV-1感染的活性 PSM对试验毒株感染GHOST（3）X4／Hi5细胞的抑制作用的半最大效应浓度（EC50）分别为5.78、0.77μg／mL，对中国临床分离毒感染GHOST（3）X4／Hi5细胞的抑制作用EC50从1.70μg／mL到3.15μg／mL（表1）。PSM 对北美 HIV-1毒株JR-FL和 HXB2均有很强的抑制作用，为了观察PSM抑制HIV-1假病毒感染是否依赖于病毒膜蛋白本研究还观察了PSM对VSV-G假病毒的抑制作用（图1）。发现即使当PSM浓度达到20μg／mL时，依然没有表现出明显的病毒抑制活性。这说明，PSM抑制HIV-1对易感细胞的感染依赖于病毒膜蛋白160。

2.2 PSM对VK2／E6E7细胞具有低毒性 高浓度（10 000 μg／mL）PSM 与 VK2／E6E7孵育6、12和24h后，其对细胞的细胞毒作用很小，60%以上VK2／E6E7细胞仍然能够存活（图2）。在药物和细胞相互作用48h后，凋亡细胞与全部细胞之比为50%时所对应的药物浓度（IC50）也大于6 000μg／mL，远远大于药物抗病毒的EC50值（0.77～5.76μg／mL）。

表1 PSM 对 HIV-1感染 GHOST（3）X4／Hi5细胞的抑制作用

图1 PSM对JR-FL，HXB2和VSV-G假病毒感染GHOST（3）X4／Hi5细胞的抑制结果

图2 PSM对VK2／E6E7细胞的低细胞毒作用

2.3 PSM对阴道乳酸杆菌的生长的影响 本研究观察了PSM对于阴道乳酸杆菌阴道生长的影响情况（图3）。结果发现PSM对阴道乳酸杆菌生长没有影响，即使在最高PSM浓度下（50 000μg／mL），阴道乳酸杆菌的生长密度没有明显变化。

2.4 PSM对上皮细胞紧密连接相关蛋白表达的影响 本研究利用qRT-PCR技术检测了PSM是否会降低生殖道上皮细胞 HEC-1-A的紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin和 Occludin的表达（图4）。发现PSM并不明显抑制ZO-1的表达，相反增加了E-cadherin和Occludin的转录水平。而阳性对照TNF-α对3种细胞紧密连接蛋白均有下调作用。

图3 PSM对阴道乳酸杆菌生长的影响

图4 PSM对HEC-1-A细胞紧密连接蛋白表达的影响

3 讨 论

易感细胞表面表达的CD4分子是HIV感染宿主细胞的受体，然而完成感染还需要辅助受体CCR5或者CXCR4分子［13－15］。GHOST （3）X4／Hi5细胞是人骨髓瘤细胞经过基因工程构建后能够稳定表达HIV病毒感染宿主细胞所需要的CD4受体分子及其所需要的辅助受体CCR5和CXCR4分子的细胞。GHOST（3）X4／Hi5是HIV易感细胞，可用于病毒滴度检测和观察PSM对HIV-1的抑制活性。VK2／E6E7细胞是人阴道上皮细胞株，可以在体外检测PSM的细胞毒性即安全性。本研究所用到的6株试验毒株（JR-FL、HXB2、CNE6、CNE30、CNE50和CNE55）代表了B、B′、B′C和 AE亚型。JR-FL是CCR5嗜性的，HXB2是CXCR4嗜性的，其余的从中国患者外周循环血中分离得到［9］，也具有不同的嗜性和很好的代表性。本研究结果显示PSM对所选的实验毒株具有较好的抑制作用。理想的预防药物杀微生物剂所必须具备的首要条件就是安全，所以本研究随后观察了PSM对阴道上皮细胞、阴道正常共生菌群（乳酸杆菌）和局部黏膜的完整性的影响。结果表明PSM对阴道上皮细胞株VK2／E6E7细胞具有低毒性；对阴道的正常菌群阴道乳酸杆菌的生长亦无明显的抑制作用；PSM对上皮细胞间的紧密蛋白转录水平仅轻微影响ZO-1的表达，但是促进了E-cadherin和Occludin这两种紧密连接蛋白的转录水平，说明PSM没有破坏上皮细胞间的完整性。

综上所述，本实验中PSM能够有效抑制HIV-1感染其作用强度表现一定范围浓度内的剂量依赖性。同时PSM还具有低细胞毒性和维持黏膜的完整性的特点，符合安全性要求。但其相关机制方面的研究还需进一步探索。

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The preliminary research of PSM on the inhibition of HIV-1＊

Zhang Longfeng1，Qiu Min2，Jiang Lijun3，Liu Qiang1，Jiao Zhijun1，Wu Zhiwei2△
（1.Department of Clinical Test，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu212001，China；2.Medical College of Nanjing University，Nanjing，Jiangsu210008，China；3.Department of Pediatric，the First People′s Hospital of Yangzhou City，Yangzhou，Jiangsu225001，China）

ObjectiveTo investigate the inhibiton effect of 4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid（PSM）in HIV-1.MethodsThe inhibition effect of different doses of PSM on HIV-1in susceptible cells GHOST （3）X4／Hi5was observed by Luciferase，and so did the inhibitory effect of PSM on JR-FL、HXB2、CNE6，CNE30，CNE50，CNE55.The cellular toxicity of PSM on the VK2／E6E7 was also evaluated by CCK8kit.The transcript level of tight junction proteins（ZO-1，E-cadherin and Occludin）of HEC-1-A were analyzed by qRT-PCR.And then observed the effect of PSM on expression of genitourinary epithelial cells HEC-1-A，so we could evaluated the effect of integrity of local mucosal indirectly.ResultsThe results showed that PSM exhibited potent antiviral activity against a broad spectrum of HIV-1major isolates with different genotypes and biotypes（EC50value of JR-FL，HXB2，CNE6，CNE30，CNE50，CNE55were 5.78，0.77，1.85，3.15，1.70，2.27μg／mL respectively）.Meanwhile，it had less cytotoxicity on VK2／E6E7.qRT-PCR showed that no obvious restrain effect on expression of ZO-1was observed and PSM increased the level of transcription of E-cadherin and Occludin.ConclusionPSM may be a potential agent for the prevention of HIV-1infection.

4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid；antiviral；HIV-1

R373.9

A

1671-8348（2015）01-0001-03

10.3969／j.issn.1671-8348.2015.01.001

国家卫计委“十二五”传染病重大专项项目（2012ZX10001007-009）；江苏大学医学临床科技发展项目基金资助项目（JLY20120169）。

张龙锋（1980－），主管检验师，硕士，主要从事免疫学方向研究。△

，Tel：（025）83686092；E-mail：wzhw＠nju.edu.cn。

2014-08-18

2014-10-30）

·论 著·