文∕徐亚麦 赵泽民 褚晓波

（黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司）

胆碱是人类生长过程中不可缺少的一种水溶性维生素，研究表明胆碱具有促进脑发育和提高记忆能力的作用。胆碱对胎儿的发育极其重要，尤其是在大脑发育阶段，它能影响神经管的闭合、终生记忆力和学习能力。试验证明，在婴幼儿时期摄入适量的胆碱能够帮助提升宝宝的记忆能力。联合国标准中已将胆碱列为婴儿配方食品中的必需成分，我国1994年就已发布的GB 14880《食品营养强化剂使用卫生标准》中也规定了胆碱可以用于婴幼儿配方奶粉，并于1997年颁布了胆碱含量测定的国标方法GB/T 5413.20《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》。

随着胆碱在婴幼儿奶粉和食品中使用的越来越广泛，胆碱含量的测定愈来愈受到人们的重视，检测方法也得到了发展。目前对胆碱含量的检测方法有高效液相色谱法、液质法、离子色谱法、酶比色法、雷氏盐法，甚至还有酶联免疫试剂盒法。这些方法中，传统方法操作繁琐，干扰因素多；仪器分析和试剂盒法对仪器要求比较高，不易推广应用；现行国标酶比色法所需酶种类多，不易购买，实验操作也较难控制。而本实验所采用的雷氏盐比色法以所需试验器材简单、成本低、稳定性好等优点而受到多数乳品企业的欢迎。

1 材料和方法

1.1 实验原理

试样中的胆碱用氢氧化钡—甲醇—三氯甲烷混合溶液水解抽提，经弗罗里硅土层析净化，与雷纳克铵盐溶液形成粉红色的胆碱雷纳克铵盐，用丙酮溶解洗脱，于526 nm测定吸收值。在一定浓度范围内，胆碱雷纳克铵盐颜色的深浅与其含量成正比。

1.2 试剂

本实验中所用试剂除特殊指明外均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。

弗罗里硅土：100～200 目，650 ℃活化。

饱和氢氧化钡-甲醇-三氯甲烷溶液：称取6 g氢氧化钡溶于100 mL甲醇中，超声溶解后加入10 mL三氯甲烷，混匀。

冰乙酸-甲醇溶液：体积比1∶10。

雷纳克铵盐溶液：称取0.25 g雷纳克铵盐，加入10 mL水中，超声10～20 min，用滤纸过滤，滤液备用。该溶液要根据实际用量现用现配，避免损失。

胆碱酒石酸氢盐标准溶液：浓度为1 g/L，准确称取在（102±2）℃烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐0.1000 g，用水定容至100 mL容量瓶中。

注意：为了保证实验效果，所有溶液均需现用现配。

1.3 仪器

250 mL磨口三角瓶；回流管；恒温水浴锅；层析柱（长约10 cm、内径1 cm的带50 mL杯口的玻璃柱，使用前用乳胶管连接层析柱与滴头，用少量脱脂棉堵住底部，倒入5～10 cm高的弗罗里硅土，用少量甲醇浸湿）；紫外分光光度计（日本岛津，UV1700）。

1.4 实验方法

1.4.1 试样制备

称取奶粉样品10.00 g于磨口三角瓶中，加入50 mL 氢氧化钡-甲醇-三氯甲烷抽提液，于（79±2）℃水浴锅内水解抽提4 h。水解过程要经常摇动，避免结块。水解后冷至室温，过滤，滤渣用冰乙酸-甲醇混合液洗涤3～4 次，洗液一并收集于100 mL容量瓶中。用甲醇定容。

1.4.2 净化与显色

依次向层析柱中加入10 mL水解液、15 mL甲醇、20 mL乙酸甲酯、5 mL雷纳克铵盐溶液。净化时，层析柱中每一种试剂排净后方可加入下一种试剂。之后用冰乙酸洗去过量的雷氏盐，最后用丙酮溶解、洗脱胆碱雷氏盐粉红色谱带，收集洗脱的红色丙酮溶液于10 mL容量瓶中，用丙酮定容。

标准溶液分别吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL注入层析柱中，按试样净化步骤操作。

用丙酮调零，在波长526 nm处测定试样及标准系列溶液的吸光值，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线计算试样胆碱含量。

2 结果与讨论

2.1 实验过程中尤其要注意水解温度，温度过低样品水解不充分，温度太高又会导致胆碱损失，因此要严格控制水解温度。

2.2 为保证水解充分，水解时，水浴溶液要没过磨口三角瓶内的样品溶液。水解过程要时时摇动，避免结块。若发生结块，可以用玻璃棒打碎结块，挂壁的结块用玻璃棒刮下来，之后再用少量抽提液将玻璃棒冲洗干净。

2.3 制备层析柱时，脱脂棉的作用是防止弗罗里硅土脱落，脱脂棉使用太多将影响净化速度。因此脱脂棉的使用量要尽量少，能挡住弗罗里硅土即可。

2.4 弗罗里硅土不能重复使用。

2.5 用冰乙酸洗脱时，不要一次性加入，要分2～3 次洗涤，直至流出的液体为无色。冰乙酸总消耗量约为20 mL，浓度为99%。

2.6 用丙酮洗脱时也要分2～3 次洗涤，这样可以避免洗脱不彻底，结果偏低的问题。洗脱液若混浊，可以用0.45 µm滤膜过滤。

3 结论

采用雷氏盐比色法测定婴幼儿奶粉中的胆碱含量，方法检出限为5 mg/100 g，精密度为8%。该方法准确、快速、简便、重现性好，适合乳品企业对婴幼儿奶粉中胆碱含量的日常监控。

[1]GB 5413.20—2013 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定.

[2]赵红霞，郝万清.雷氏盐比色法检测婴幼儿配方乳粉中胆碱含量.乳业科学与技术，2012（2）：41-43.

[3]顾秀英，欧菊芳，杨琳，等.离子色谱法测定奶粉中胆碱质量分数.中国乳品工业，2011（7）：47-49.

[4]张丽娟，李伟英.婴儿奶粉及食品中胆碱的测定.营养学报，1993（2）：207-211.

[5]黄丽，刘京平，容晓文.在线渗析-离子色谱法直接测定奶粉中胆碱.中国卫生检验杂志，2008（3）：444-445.