周晓波，赵成鹏，王鎏，张朋，唐旭，段永福

（河南省南阳市中心医院小儿外科，河南 南阳 473000）

·论著·

肿瘤抑素影响婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖与凋亡的相关机制

周晓波，赵成鹏，王鎏，张朋，唐旭，段永福

（河南省南阳市中心医院小儿外科，河南 南阳 473000）

目的观察肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖及凋亡的影响，并对相关机制进行初步探讨。方法采用0、5、10、20和40μg/ml的肿瘤抑素及40μg/ml的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞0、12、24和48 h，采用MTT方法及流式细胞术检测婴幼儿血管瘤内皮细胞的增殖及凋亡情况。采用Western blot方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK和mTOR的磷酸化水平。结果同0μg/ml肿瘤抑素处理组相比，5、10、20和40μg/ml的肿瘤抑素均可显著抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞的增殖能力，并促进婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡（P＜0.05），且这种作用具有计量依赖性。同0 h处理组相比，40μg/ml的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞2、24和48 h均可显著抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞的增殖能力，并促进婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡（P＜0.05），且这种作用具有时间依赖性。同对照相比，肿瘤抑素可上调婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK的磷酸化水平，下调mTOR的磷酸化水平。结论肿瘤抑素可通过激活AMPK通路，进而抑制mTOR通路，从而抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞的增殖能力，并促进婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡。

肿瘤抑素；婴幼儿血管瘤；内皮细胞；增殖；凋亡

婴幼儿血管瘤是婴幼儿最常见的良性肿瘤，其发病率约为4%～12%。目前针对婴幼儿血管瘤的治疗方法包括类固醇激素治疗和常规抗肿瘤药物治疗等[1]。血管生成是婴幼儿血管瘤发生的先决条件，其在婴幼儿血管瘤快速生长中发挥重要的作用[1]。肿瘤抑素（tumstatin）是新近发现的一种起源于血管基底膜IV型胶原的内源性血管内皮细胞生长抑制因子[2-4]，由244个氨基酸组成，分子量约为28 kD。肿瘤抑素是一种很强的血管生成抑制因子，可选择性地抑制血管内皮细胞增殖，是目前发现的一种具有良好的应用前景的抗血管生成和抗肿瘤药物[5]。然而，目前关于肿瘤抑素在婴幼儿血管瘤内皮发生发展中的作用，以及肿瘤抑素发挥作用的机制还很少有文献报道。据此，本研究通过体外分离获取婴幼儿血管瘤内皮细胞，观察了肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖及凋亡的影响，并对肿瘤抑素发挥作用的机制进行了初步的探讨。

1 材料与方法

1.1主要试剂

p-AMPK抗体和p-mTOR抗体购自Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG购自Snata Cruz公司，Cyto-Buster蛋白提取试剂购自Novagen公司，蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自Thermo公司。

1.2婴幼儿血管瘤内皮细胞获取及鉴定

婴幼儿血管瘤内皮细胞获取及鉴定方法参见文献报道[1]。

1.3细胞处理

采用0、5、10、20和40μg/ml的肿瘤抑素及40μg/ml的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞0、12、24和48 h。

1.4MTT方法检测细胞增殖能力

上述肿瘤抑素处理的细胞培养至对数生长期，接种于96孔培养板中，采用不同浓度和不同时间的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后，每孔中加入20μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150μl的二甲基亚砜（DMSO）溶液，低速震荡10 min后，波长490 nm处测定OD值。

1.5凋亡检测

收集上述肿瘤抑素处理细胞离心，1 000×g离心5 min，以含1%BSA的磷酸缓冲液（PBS）洗涤1次。用100μl Binding缓冲液将细胞重悬，加入2μl Annexin V染料和0.1μl PI染料，避光15 min，以含1%BSA的PBS洗涤2次。

1.6细胞总蛋白提取

上述细胞采用冰PBS洗涤2次，400×g离心，5 min；弃去细胞上清，于沉淀中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂和CytoBuster蛋白提取试剂，吹打混匀，室温放置15 min；4℃，12 000×g离心15 min；所得上清部分即细胞总蛋白，留部分细胞总蛋白检测蛋白浓度，其余每管15μl分装，-80℃冻存。

1.7BCA法测定蛋白浓度

严格按BCA试剂盒说明书进行标准品BSA的稀释；按体积比为50∶1混合试剂盒中的试剂A和试剂B，即为工作液；96孔板中每孔加入200μL的工作液，随后加入25μl倍比稀释的标准品或待测样品，每种样品设置3个复孔。37℃孵育30 min后波长562 nm处测定OD值；根据标准品的光密度值和浓度梯度绘制出标准曲线，根据标准曲线及待测样品的OD值推算出样品浓度。

1.8Western blot

等量的提取上述蛋白经8%～10%SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶分离后，半干转印至硝酸纤维素膜上，采用含5%BSA的TBST室温孵育封闭2 h，加入鼠抗人p-AMPK抗体或p-mTOR抗体，4℃过夜孵育。次日以0.1%TBST洗膜3次，每次5 min，加入相应种属的HRP标记二抗，室温孵育1 h。0.1% TBST洗膜后，采用Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。Actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。使用Image J软件进行定量分析。

1.9统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。两组数据间比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖的影响

如图1所示，随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长，婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖能力逐渐降低（P＜0.01）。

2.2肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡的影响

如图2所示，随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长，婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡水平逐渐升高（P＜0.01）。

2.3 肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影响

如图3所示，随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长，婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK蛋白磷酸化水平逐渐升高。

2.4肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞中mTOR蛋白磷酸化水平的影响

如图4所示，随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长，婴幼儿血管瘤内皮细胞中mTOR蛋白磷酸化水平逐渐降低。

3 讨论

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝/苏氨酸蛋白质激酶。细胞在接受外源营养物质和生长因子信号刺激后，均可通过mTOR信号通路向细胞内传递信号。同时，mTOR信号通路的活化水平还受AMPK（AMP激活的蛋白质激酶，AMP activated potein kinase）活化水平的的调节[6-7]。研究显示，p53可通过调节AMPK/ mTOR信号通路的活化水平，进而调节细胞自噬[8-9]。同时，AMPK/mTOR信号通路在调节细胞生长增殖、存活、自噬、凋亡等生理过程中也具有重要的作用[10]。据此，本研究观察了AMPK/mTOR信号通路在肿瘤抑素（tumstatin）调节婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖及凋亡水平中的作用。肿瘤抑素是新近发现的一种具有很强的抑制血管生成作用的因子，可选择性地抑制血管内皮细胞增殖[5]。本研究通过分离获取婴幼儿血管瘤内皮细胞，在体外采用不同浓度的肿瘤抑素及相同浓度的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间，以观察肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖及凋亡水平中的作用。结果显示，在体外采用0、5、10、20和40μg/ml的肿瘤抑素及40μg/ml的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞0、12、24和48 h，与对照组相比，肿瘤抑素可显著抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖，并促进婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡，且此作用具有剂量及时间依赖性。进一步对AMPK/mTOR信号通路在肿瘤抑素调控婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖和凋亡中的作用研究发现，肿瘤抑素可上调婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK的磷酸化水平，下调mTOR的磷酸化水平，且此作用同样具有剂量及时间依赖性。肿瘤抑素的这种通过AMPK/mTOR信号通路调控婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的作用与文献报的亚硒酸钠可通过调控结直肠癌HT-29细胞中AMPK及其下游靶蛋白mTOR而对HT-29细胞凋亡产生影响的结果相一致[11]。综述所述，本研究结果提示，肿瘤抑素可通过调AMPK/mTOR信号通路的活化水平，进而调节婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖及凋亡水平。然而，关于其他信号通路分子，如p53分子是否在肿瘤抑素调控婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖和凋亡中具有一定的作用还需进一步的深入研究。

[1]侯团结,刘漪沦,李松平,等.肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖活力与细胞周期的影响[J].实用临床医药杂志,2013,17 (7):8-11.

[2]ZHANG GM,ZHANG YM,FU SB,et al.Effects of cloned tumstatin-related and angiogenesis-inhibitory peptides on proliferation and apoptosis of endothelial cells[J].Chin Med J,2008,121(22): 2234-2230.

[3]GU Q,SUN C,LUO J,et al.Inhibition of angiogenesis by a synthetic fusion protein VTF derived from vasostatin and tumstatin[J].Anticancer Drugs,2014,25(9):1044-1051.

[4]KUZNETSOV SL,LIKHVANTSEVA VG,ARUTIUNIAN EV,et al.Investigation of possible approaches to angiogenesis regulation in vitro with the help of recombinant fragments of angiogenesis inhibitors such as endostatin,tumstatin and PEDF[J].Vestn Ross Akad Med Nauk,2013(4):63-67.

[5]HAMANO Y,KALLURI R,TUMSTATIN.The NC1 domain of alpha3 chain of type IV collagen,is an endogenous inhibitor of pathological angiogenesis and suppresses tumor growth[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,333(2):292-298.

[6]GUO Z,CAO G,YANG H,et al.A combination of four active compounds alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with inhibition of autophagy and modulation of AMPK/mTOR and JNK pathways[J].J Neurosci Res,2014,92 (10):1295-1306.

[7]ZHAN JK,WANG YJ,WANG Y,et al.Adiponectin attenuates the osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells through the AMPK/mTOR pathway[J].Exp Cell Res,2014,323 (2):352-358.

[8]EGAN DF,SHACKELFORD DB,MIHAYLOVA MM,et al. Phosphorylation of ULK1(hATG1)by AMP-activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy[J].Science,2011, 331(6016):456-461.

[9]KIM J,KUNDU M,VIOLLET B,et al.AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1[J].Nat Cell Biol,2011,13(2):132-141.

[10]DAZERT E,HALL MN.mTOR signaling in disease[J].Curt Opin Cell Biol,2011,23(6):744-755.

[11]骆新,石劲松,卢伟,等.亚硒酸钠对结直肠癌HT 29细胞AMPK/mTOR通路活化及凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2014, 34(14):3935-3937.

Effect of tumstatin on proliferation and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma

Xiao-bo ZHOU,Cheng-peng ZHAO,Liu WANG,Peng ZHANG,Xu TANG,Yong-fu DUAN
(Department of Pediatrics Surgery,Nanyang Central Hospital,Nanyang,Henan 473000,P.R.China)

【Objective】To observe the effect of tumstatin on proliferation and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma,and study the related mechanism.【Methods】Endothelial cell in infantile hemangioma was treated with tumstatin with different concentrations(0,5,10,20 and 40 μg/ml)or in a time dependent manner(0, 12,24 and 48 h),then the proliferation ability and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma were detected by MTT and FCM,phosphorylation level of AMPK and mTOR were detected by Western blot.【Results】Compared with 0 μg/ml tumstatin treated group,5,10,20 and 40 μg/ml tumstatin treated can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma(P＜0.05),and those effect were concentration dependent.Compared with 0 h tumstatin treated group,12,24 and 48 h tumstatin treated can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma(P＜0.05),and those effect were time dependent.Compared with control group,tumstatin treated can active AMPK signaling pathway and inhibit mTOR signaling pathway in endothelial cell in infantile hemangioma.【Conclusion】By active AMPK signaling pathway and inhibit mTOR signaling pathway, tumstatin can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma.

tumstatin;infantile hemangioma;endothelial cell;proliferation;apoptosis

R730

A

1005-8982（2015）28-0017-05

2015-04-26