马登磊，张兰，李林

脑外伤动物模型认知障碍评价方法研究进展①

马登磊，张兰，李林

认知障碍是脑外伤常见的后遗症之一。脑外伤动物模型目前广泛应用于基础和药物研究中，也出现了多种评价该模型的认知障碍评价的方法。本文综述近年来不同研究者对脑外伤动物模型认知障碍的行为学评价方法。

脑外伤；动物模型；认知障碍；行为学评价；综述

[本文著录格式]马登磊，张兰，李林.脑外伤动物模型认知障碍评价方法研究进展[J].中国康复理论与实践,2015,21(1): 65-68.

CITED AS:Ma DL,Zhang L,Li L.Advance in cognitive behavior assessment for traumatic brain injury animal models(review)[J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):65-68.

脑外伤(traumatic brain injury,TBI)为外力对大脑的损害，已经成为影响青年人生命健康的重要原因之一，为社会带来严重的经济和精神负担[1]。脑外伤的急性损伤和继发损伤可以引起永久功能性损伤，包括运功功能障碍、认知能力损伤、神经行为异常等[2]。

认知障碍是脑外伤的常见后遗症之一，即使是脑震荡和轻度脑外伤也会出现认知功能下降。研究显示，近65%中重度脑外伤患者有长期的认知功能问题，15%轻度脑外伤患者也会有包括认知损伤在内的后遗症长期存在。认知障碍是脑外伤致残的首要原因，影响近43%的中重度患者[3]。另外，目前很多学者认为，脑外伤是阿尔茨海默病的危险因素之一[4]。因此，很多研究开始在脑外伤动物模型上评价认知行为的变化，并在此基础上寻找合理有效的治疗方法。本文总结近年来不同研究者在脑外伤动物模型上针对认知障碍的行为学评价方法，主要包括的动物模型有自由落体撞击伤(Feeney's weight-dropping)模型、液压冲击伤(fluid percussion injury,FPI)模型、控制性皮层损伤(controlled cortical impact,CCI)模型、闭合性脑损伤(closed head injury,CHI)模型、旋转加速损伤模型等[5]。

1 Morris水迷宫

Morris水迷宫(Morris Water Maze,MWM)是由心理学家Morris发明并用于评价海马病变大鼠的空间记忆能力的行为学方法[6]。MWM可以用来检测记忆和学习能力、空间参考记忆和空间工作记忆。目前MWM是国内外学者广泛应用于多种模型的认知能力评价方法，同时它也是评价脑外伤模型认知障碍应用最多的行为学方法。

MWM由圆形水池、自动摄像机及电脑分析系统组成。圆形水池被等分为4个象限，以水池边缘相等分布的4个点作为入水点，站台位于某一象限内。测试前将水注入池中，水面高出站台表面，使大鼠或小鼠不能见到站台。加入某种不影响实验的物质以使水变得不透明并将水面的颜色和动物颜色区别开。水温控制恒定。实验在隔音、较暗的房间内进行，各种实验条件保持不变[7]。

目前有多种模型使用该方法测试认知能力，并应用于药物研究中。考虑到脑外伤模型会造成运动障碍，因此为了排除运动障碍对MWM中表现的影响，有学者在进行水迷宫测试之前使用神经功能损伤评分(neurological severity scale,NSS)等对其运动功能进行评定。不同研究模型损伤程度不同以及模型的自我恢复程度不同，因此MWM显示的脑外伤模型大鼠存在认知障碍的时间有所不同，从损伤后1周内到1年均有报道：CHI模型大鼠损伤后1周[8]，Feeney's自由落体模型大鼠伤后2周[9]，FPI模型大鼠损伤后1周内到8周[10-11]，CCI模型小鼠损伤后7周[12]、大鼠损伤后1年[13]。考虑到每个实验室模型及行为学

方法测试操作的不一致，不同实验室得出的行为学结果也可能存在一些差异。

目前经典的MWM检测方法主要包括定向航行实验、空间探索实验(撤台实验)和露台实验。

1.1 定向航行实验

平台固定在水面下，动物在不同象限入水，用60 s或120 s探索平台。每天训练2～5次，每天在同一时间进行训练，一般连续训练2～5 d或更长时间[8-9,11-13]。训练的主要目的是为了使动物能够凭空间记忆准确定位平台的位置。该实验记录动物到达平台的时间，即逃避潜伏期，用于评价动物的空间学习记忆能力。

1.2 空间探索实验

一般在定向航行实验结束后24 h进行，也有学者在每天进行完定向航行实验之后进行一次空间探索实验[14]。实验时将平台撤去，一般选择平台所在位置的对侧象限为动物入水点。动物入水后，限时60～120 s，实时监控记录动物游泳轨迹。记录限定时间内动物进入目标区域(原平台所在位置)的次数和累计时间，以及动物进入目标象限的时间等指标，用于评价动物的空间工作记忆。

1.3 露台实验

一般在水迷宫测试之前或测试的最后进行[10,13]。平台露出水面，动物入水，记录其找到平台的时间、游泳速度等。该指标一般用来检测动物是否存在影响水迷宫中表现的运动障碍，进而排除模型动物因运动障碍对测试结果造成的影响。

除了前述经典实验方法外，有些学者对方法进行了适当的改良，包括测试时间、检测指标等。经典的水迷宫测试要用将近1周时间，有些学者为了缩短测试周期而进行改良。改良后的测试方法只需要1 d就可以完成训练和测试[10]。选择不同的入水点，多次入水训练60 s，每次训练间有一定的间隔时间。之后可以分别进行露台实验和空间探索实验。该方法1 d内完成，主要测试动物的短时记忆。测试1 d后，有学者在第2天进行反转探索实验[15]，即第2天训练方式同第1天类似，但平台的位置移动到原来位置的对侧象限。记录动物的逃避潜伏期、探索方式(包括直线式、趋向式)等，评价动物的认知能力。

平台的位置在训练过程中除了保持不动之外，还可以在每次训练时变更其在象限中的位置。经典的方法中，平台固定对于动物来说记忆起来相对简单，而且在空间探索实验时动物的探索容易受到干扰。通过移动平台等方式对其进行改良，能更准确地测定空间探索能力，不仅测试参考记忆能力，还测试转换探索策略的能力。该方法在每次航行训练中，平台的位置在目标象限内随机变换，包括中心和水池边缘的中间点、水池边缘附近、靠近中心附近、目标象限边缘等。这样在最后一次空间探索时，动物就会在目标象限内寻找平台，避免动物在找不到平台时放弃的情况发生[16]。测试时，每天进行4次训练，连续5 d，选择不同入水点，平台位于目标象限不同位置。记录动物在目标象限的时间和找到平台的潜伏期作为评价指标[17]。

除了改良测试方法外，有些研究者通过改良记录数据或统计数据的方法来达到自己的研究目的。例如在进行定向航行实验时，连续7 d每天训练2次，间隔5 min。其中第1次训练结果反映动物对前一天训练结果的记忆，即长时程记忆；而第2次训练结果反映的是动物对5 min前训练结果的记忆，即短时程记忆。通过分析不同指标的变化，达到测试动物不同类型记忆能力的目的[18]。另外也有学者在进行空间探索实验时，记录一定时间内动物在不同区域内的时间。之后用在不同区域的时间乘以相应区域的权重(离平台越近，权重越大)，计算出分值用来评定记忆能力[19]。

2 物体识别实验

物体识别实验(Object Recognition Task,ORT)是由Ennaceur等基于大鼠对新旧物体有不同的喜好而设计，用于检测大鼠记忆的行为学方法[20]。物体识别装置主要由一个测试盒和两套测试物体(各2个)组成，测试物体在实验前经筛选有近似的喜好程度。测试物体均足够重，以防止动物推动。测试环境要求在隔音、避光的场所。在测试盒上方以白色光源照射使盒内无阴影处[21]。

测试分为3个阶段。①适应期，测试第1天或前3天，每天将动物放置到测试盒中，无测试物体，让动物自由探索5～60 min。每只动物做完后要对测试盒进行清洁和70%酒精擦拭，以去除气味。②训练期，在适应期完成24 h后，将动物放回到测试盒中，此时盒中放置两个相同的物体。记录5 min内动物探索每个物体的时间。③测试期，在训练期完成1～24 h后，将动物放回测试盒中，此时盒中放置一个旧物体一个新物体。测试5 min内动物探索新旧物体的时间。计算分辨指数(分辨指数=探索新物体的时间/总探索时间)。

目前有多个脑外伤模型用该方法在脑损伤后的不同时间测试动物的认知水平，并应用于药物的研究：FPI小鼠模型于伤后1周[22]，CCI小鼠模型伤后4周[23]，CHI小鼠模型于伤后1～13周[24-25]等，ORT后均显示不同程度认知障碍。不同实验室、不同的模型及损伤程度，导致认知障碍出现的时间不一致。

3 回避实验

脑外伤模型涉及到包括海马在内的多个脑组织损伤。水迷宫实验主要检测海马相关的记忆损害，而回避实验检测的认知不依赖海马加工处理，因此也用于脑外伤模型中评价动物的认知功能[7]。回避实验包括被动回避实验和主动回避实验。被动回避实验主要分为避暗实验和跳台实验。其中，避暗实验利用大鼠或小鼠趋暗的特性。实验装置分为明暗两室，明室有灯照射，暗室底部有通电铜栅，两室间有小门连接。训练时将动物放置在明室，因其嗜暗的特性钻入暗室，此时动物接受电击获得记忆。24 h后，记录其300 s内进入暗室的次数作为错误次数，第1次进入暗室的时间为步入潜伏期[26]。

另有学者使用一个分层的电脑控制的行为学方法。实验装置为直径82 cm的金属圆台，40 cm的透明墙，可以让动物观察到房间的标记。该实验选在脑外伤后1周，此时运动功能已经恢复，不会影响行为学表现。本行为学测试包括3个任务。任务一为旷场实验(open-field test)，此时圆台固定且不通电。

在圆台上移动的距离代表动物对环境的适应程度及其探索能力。任务二为被动位置回避实验(passive place avoidance test)，此时圆台上有一个60°的扇形通电区域。大鼠接受4次训练，每次10 min，间隔10 min。记录进入电击区的次数反映大鼠逃避电击区的能力，移动的距离反映大鼠在恶劣环境下控制活动的能力。24 h后，大鼠接受密集的或间隔的主动位置回避实验(massed or spaced active place avoidance test)，此时圆台以1 r/min的转速旋转，有固定的60°扇形通电区域。如果大鼠接受的是密集主动位置回避实验，则需要接受6次训练，每次10 min，间隔10 min。记录电击区进入次数反映的是海马相关的短时记忆。如果第2天仍接受6次训练，则第2天的第1次训练结果反映的是24 h的记忆维持。如果大鼠接受的是间隔的主动位置回避实验，则每天训练20 min，连续训练15 d[27-28]。

4 其他方法

比较常用的测试学习记忆能力的方法包括放射状臂形迷宫(radial arm water maze,RAWM)、Lashley迷宫(Lashley maze)、Y型迷宫(Y maze)。

放射状臂形迷宫为测试啮齿类动物空间辨识能力的方法。提前禁食，通过在不同的臂末端放置食物，训练动物在迷宫中做出正确选择得到食物。记录动物进入错误臂的次数用来评价认知能力。有研究用该方法测试，FPI后4 d或25 d，均显示动物认知能力下降[29-30]。

Y迷宫根据动物喜欢探索的天性来测试其认知能力。有研究在脑外伤损伤后3 d或1个月时用该方法测试动物认知的变化[12,24]。

Lashley迷宫是一个相对比较复杂的迷宫，其中包括盲道和T选择，需要经过训练，学习正确的左转和右转顺序才能够完成。有研究在脑外伤后1个月内用Lashley迷宫测试脑损伤后对认知的影响[31]。

味觉厌新实验(gustatory neophobia test)利用动物在进食时会选择熟悉食物的特性而设计。该方法不需要任何装置，只需要提前禁食一段时间，之后给予4种不同食物任动物选择，其中3种为新食物。正常动物会选择熟悉的食物，而脑损伤的动物不会表现出对某种食物的偏好[32]。

5 展望

随着脑外伤基础研究及治疗研究的不断深入，损伤后的认知障碍作为其主要后遗症之一，受到越来越多的关注。测试脑损伤后认知障碍的行为学方法，对于脑外伤的机制研究以及药物研发必不可少。行为学方法要满足最大程度的模拟临床、可重复性高、简单易行等要求。现在脑外伤研究中应用比较多的行为学方法主要是已经发展比较成熟的测试方案。但因为脑外伤模型有其特殊性，有些经典的测试认知的行为学方法可能出现不适用的情况，需要操作者予以改良或配合使用其他行为学方法。例如脑外伤会引起感觉运动功能障碍，而很多行为学方法需要动物有正常的感觉运动功能，因此需要排除运动功能损伤对行为学测试结果的干扰。另外，不同的脑损伤模型对脑组织的损伤部位和程度不一致，类型有弥漫性损伤和局灶性损伤，程度也有轻中重之分，适用的行为学方法以及最佳的测定时间可能都不一致。因此未来需要建立一种适用于测试脑外伤后认知障碍的行为学方法，除了能最大程度模拟临床外，还能够避免损伤后运动障碍对测试的影响，而且对于不同的损伤模型有相应的测试方法等。

[1]Maas AI,Stocchetti N,Bullock R.Moderate and severe traumatic brain injury in adults[J].Lancet Neurol,2008,7(8): 728-741.

[2]Riggio S.Traumatic brain injury and its neurobehavioral sequelae[J].Neurol Clin,2011,29(1):35-47.

[3]Rabinowitz AR,Levin HS.Cognitive sequelae of traumatic brain injury[J].Psychiatr Clin NorthAm,2014,37(1):1-11.

[4]Sivanandam TM,Thakur MK.Traumatic brain injury:A risk factor for Alzheimer's disease[J].Neurosci Biobehav Rev, 2012,36(5):1376-1381.

[5]王娜,李林.创伤性脑损伤动物模型的研究进展[J].中国康复理论与实践,2009,15(10):905-907.

[6]Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J].J Neurosci Methods,1984,11 (1):47-60.

[7]Fujimoto ST,Longhi L,Saatman KE,et al.Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury[J].Neurosci Biobehav Rev,2004,28(4):365-378.

[8]Sikoglu EM,Heffernan ME,Tam K,et al.Enhancement in cognitive function recovery by granulocyte-colony stimulating factor in a rodent model of traumatic brain injury[J].Behav Brain Res,2014,259:354-356.

[9]Si D,Wang H,Wang Q,et al.Progesterone treatment improves cognitive outcome following experimental traumatic brain injury in rats[J].Neurosci Lett,2013,553:18-23.

[10]Sanders MJ,Dietrich WD,Green EJ.Cognitive function following traumatic brain injury:effects of injury severity and recovery period in a parasagittal fluid-percussive injury model[J].J Neurotrauma,1999,16(10):915-925.

[11]Hou Z,Luo W,Sun X,et al.Hydrogen-rich saline protects against oxidative damage and cognitive deficits after mild traumatic brain injury[J].Brain Res Bull,2012,88(6):560-565.

[12]Watanabe J,Shetty AK,Hattiangady B,et al.Administration of TSG-6 improves memory after traumatic brain injury in mice[J].Neurobiol Dis,2013,59:86-99.

[13]Dixon CE,Kochanek PM,Yan HQ,et al.One-year study of spatial memory performance,brain morphology,and cholinergic markers after moderate controlled cortical impact in rats[J].J Neurotrauma,1999,16(2):109-122.

[14]Schmidt RH,Scholten KJ,Maughan PH.Time course for recovery of water maze performance and central cholinergic in-

nervation after fluid percussion injury[J].J Neurotrauma, 1999,16(12):1139-1147.

[15]Shultz SR,Bao F,Omana V,et al.Repeated mild lateral fluid percussion brain injury in the rat causes cumulative long-term behavioral impairments,neuroinflammation,and cortical loss in an animal model of repeated concussion[J].J Neurotrauma, 2012,29(2):281-294.

[16]Choi SH,Woodlee MT,Hong JJ,et al.A simple modification of the water maze test to enhance daily detection of spatial memory in rats and mice[J].J Neurosci Methods,2006,156 (1-2):182-193.

[17]Ning R,Xiong Y,Mahmood A,et al.Erythropoietin promotes neurovascular remodeling and long-term functional recovery in rats following traumatic brain injury[J].Brain Res,2011, 1384:140-150.

[18]Tang H,Hua F,Wang J,et al.Progesterone and vitamin D:Improvement after traumatic brain injury in middle-aged rats[J]. Horm Behav,2013,64(3):527-538.

[19]Hicks RR,Smith DH,Lowenstein DH,et al.Mild experimental brain injury in the rat induces cognitive deficits associated with regional neuronal loss in the hippocampus[J].J Neurotrauma,1993,10(4):405-414.

[20]Ennaceur A,Delacour J.A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats.1:Behavioral data[J].Behav Brain Res,1988,31(1):47-59.

[21]宋广青,孙秀萍,刘新民.大鼠物体识别实验方法综述[J].中国比较医学杂志,2013,23(7):55-60.

[22]Ferreira AP,Rodrigues FS,Della-Pace ID,et al.The effect of NADPH-oxidase inhibitor apocynin on cognitive impairment induced by moderate lateral fluid percussion injury:Role of inflammatory and oxidative brain damage[J].Neurochem Int, 2013,63(6):583-593.

[23]Han X,Tong J,Zhang J,et al.Imipramine treatment improves cognitive outcome associated with enhanced hippocampal neurogenesis after traumatic brain injury in mice[J].J Neurotrauma,2011,28(6):995-1007.

[24]Dachir S,Shabashov D,Trembovler V,et al.Inosine improves functional recovery after experimental traumatic brain injury[J].Brain Res,2014,1555:78-88.

[25]Siopi E,Llufriu-Daben G,Fanucchi F,et al.Evaluation of late cognitive impairment and anxiety states following traumatic brain injury in mice:the effect of minocycline[J].Neurosci Lett,2012,511(2):110-115.

[26]Yamaguchi T,Ozawa Y,Suzuki M,et al.Indeloxazine hydrochloride improves impairment of passive avoidance performance after fluid percussion brain injury in rats[J].Neuropharmacology,1996,35(3):329-336.

[27]Abdel Baki SG,Kao HY,Kelemen E,et al.Ahierarchy of neurobehavioral tasks discriminates between mild and moderate brain injury in rats[J].Brain Res,2009,1280:98-106.

[28]Abdel Baki SG,Schwab B,Haber M,et al.Minocycline synergizes with N-acetylcysteine and improves cognition and memory following traumatic brain injury in rats[J].PLoS One,2010, 5(8):e12490.

[29]Lyeth BG,Jenkins LW,Hamm RJ,et al.Prolonged memory impairment in the absence of hippocampal cell death following traumatic brain injury in the rat[J].Brain Res,1990,526(2): 249-258.

[30]Corser-Jensen CE,Goodell DJ,Freund RK,et al.Blocking leukotriene synthesis attenuates the pathophysiology of traumatic brain injury and associated cognitive deficits[J].Exp Neurol,2014,256:7-16.

[31]Piot-Grosjean O,Wahl F,Gobbo O,et al.Assessment of sensorimotor and cognitive deficits induced by a moderate traumatic injury in the right parietal cortex of the rat[J].Neurobiol Dis, 2001,8(6):1082-1093.

[32]Hamm RJ,Pike BR,Phillips LL,et al.Impaired gustatory neophobia following traumatic brain injury in rats[J].J Neurotrauma,1995,12(3):307-314.

Advance in Cognitive Behavior Assessment for Traumatic Brain Injury Animal Models(review)

MA Deng-lei,ZHANG Lan,LI Lin. Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital,Capital Medical University;Beijing Academy for Brain Disorders,Beijing 100053,China

Cognitive dysfunction is common after traumatic brain injury(TBI).TBI animal models and cognitive behavior assessments are commonly used in the mechanism and pharmacology researches.This article reviewed the advance of methods of cognitive behavior assessment on TBI animal models.

traumatic brain injury;animal models;cognitive dysfunction;behavior assessment;review

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.017

R651.1

A

1006-9771(2015)01-0065-04

2014-11-13

2014-12-01)

1.国家自然科学基金项目(No.81273498)；2.北京市科技专项项目(No.Z131102002813066)。

首都医科大学宣武医院药物研究室，神经变性病教育部重点实验室，北京市100053。作者简介：马登磊(1988-)，男，汉族，河北邢台市人，博士研究生，主要研究方向：神经药理学。通讯作者：李林，女，教授，博士生导师，主要研究方向：神经药理学。E-mail:linli97@hotmail.com。