□杨 梅 赵瑞亭

红花中羟基红花黄色素A(简称羟基红花素)是红花主要的活性成分，是查耳酮类化合物，具有扩张冠脉、抗氧化、保护心肌、降血压、免疫抑制及脑保护等多种药理学功效，是用于治疗冠心病、心绞痛等心脑血管疾病的有效药物。目前其临床剂型为注射剂，口服剂型未见报道，其口服吸收程度及具体的吸收机制还不明确。但在许多口服中药复方制剂中以红花浸膏为原料，很多证据显示羟基红花黄色素A对多种疾病的治疗有益，证实了羟基红花黄色素A 口服吸收的可能性。

Caco-2 细胞(the human colon adenocarcinoma cell lines 的简称)模型是最近十几年来国外广泛采用的一种研究药物肠吸收的体外模型，在吸收过程研究中，比较简单，重复性较好，应用范围较广。目前利用Caco-2 细胞模型研究了许多化学合成药的吸收机制，对中药及有效成分的研究也有一些进展，但对红花或羟基红花黄色素A 的研究未见报道，用Caco -2 模型研究羟基红花黄色素A 的吸收机制，有助于为口服羟基红花黄色素A 剂型设计、处方和工艺的筛选提供依据，具有理论意义和实用价值。

一、材料

(一)细胞株。Caco -2 细胞(code HTB037，ATCC，American Type Culture Collection，Rockville，MD)。实验中所用代数在40 到50 代之间。

(二)主要试剂。羟基红花黄色素A 购自山东绿叶;MEM/EBSS NEAA 培养基、0．25%胰酶消化液、胎牛血清、丙酮酸钠(11．0mg/ml)购自Hyclone 公司;N -2 -羟乙基哌嗪- N’-2乙磺酸钠(Hepes)、L-谷氨酰胺、青、链霉素购自南京博全科技有限公司;碳酸氢钠分析纯购自上海虹光化工厂;维拉帕米购自连云港恒瑞制药厂。

二、实验方法

(一)细胞培养。Caco-2 细胞培养在T -75 培养瓶中，培养液为MEM/EBSS NEAA，在37℃含5% CO2培养箱中全湿度培养。细胞接种24 小时后更换培养液，以去除死细胞残渣。以后隔日换液，约5天后细胞融合达90%后传代，用37℃预热的消化液(胰蛋白酶(0．05%)+EDTA﹒2Na(0．53 mmol/L ))在室温下消化2～3 分钟，传代比率1:3。实验时细胞接种在24 孔Millicell 插入式培养皿中，接种密度7 ×104个/mL，每孔400 μL，基底侧加入培养液600 μL，接种24 小时后更换培养液，接下来一周隔天换液，一周后每日换液。细胞培养21天后待用，以跨膜电阻作为细胞单层形成的指标，电阻≥600Ω·cm2时，便可以开始用于转运实验。

(二)AP→BL 转运实验。用生长了21～24天的符合上述条件的Caco-2 细胞单层来研究羟基红花黄色素A 在Caco -2细胞单层上的转运。实验前用pH7．4 T．M．溶液轻轻冲洗2～3次(每孔800μL ，顶侧300μL，基底侧500μL)，然后用pH7．4 T．M．溶液于37℃浸泡30min，以除去细胞表面的附着物。小心吸去孔内T．M．溶液，在顶侧加入T．M．溶液配制的供试液400μL，基底侧加入600μL 空白pH7．4T． M． 溶液或含抑制剂的pH7．4T．M．溶液作为接收液。置于37℃含5% CO2培养箱中，于给药30、60、90、120、150min 于下层取样150μL，并补充空白pH7．4 T．M．溶液。每个浓度三个复孔。样品-20℃保存，待测。

(三)BL→AP 转运实验。同上法洗涤Caco -2 细胞单层，在基底侧加入T．M．溶液配制的供试液600μL，顶侧加入400μL空白pH7．4T．M．溶液或含抑制剂的pH7．4T．M．溶液作为接收液。置于37℃含5% CO2培养箱中，于给药30、60、90、120、150min 于顶侧取样150μL，并补充空白T． M． 溶液。每个浓度三个复孔(即n=3)。样品-20℃保存，待测。

(四)摄取实验。胰酶消化的细胞，用4℃的pH7．4T．M．溶液冲洗3 次(每孔800μL ，顶侧300μL，基底侧500μL)，以终止Caco-2 细胞摄取。在摄取了羟基红花黄色素A 的Caco -2 细胞中加入蒸馏水(每孔500μL，顶侧200μL，基底侧300μL)，于-70℃、37℃反复冻融3 次，破碎细胞。-20℃保存，待测。

(五)羟基红花黄色素A 转运或摄取样品的测定。转运样品12，000rpm 离心10min，取上清液HPLC 法测定浓度。

摄取样品用过滤器(孔径0．22μm)过滤，12，000rpm 离心10min，取上清液HPLC 法测定浓度。

液相条件:色谱柱:岛津shim-pack CLC-ODS 柱(150mm×6mm，5μm);流速:0．8 m l·min-1;检测波长:403nm;柱温:40℃。流动相:甲醇-乙腈-1．2%KH2PO4水溶液(24:2:74)。

羟基红花黄色素A 标准曲线的绘制:经高效液相分析，以样品中羟基红花黄色素A 量为纵坐标，峰面积为横坐标，求得的直线回归方程即为标准曲线。Y=0．3262X-0．0435，R2=0．9992，羟基红花黄色素A 在0．57～660 ng 范围内线性关系良好，相应峰面积为1．85～2050．8;精密度、样品稳定

性考察均符合规定。

三、实验结果

(一)不同pH对羟基红花黄色素A 细胞转运的影响。分别用pH4、5、6 和7．4 含200μg·ml-1 羟基红花黄色素A 浓度的供试液，进行细胞转运实验。在pH7．4～pH4 范围内，羟基红花黄色素A AP→BL方向转运的表观渗透系数Papp 为1．5 ×10-8±1．10 ×10-8～1．10 ×10-7±0．12 ×10-7cm·s-1(n =3)，随pH 的降低而显著性增加，在pH5～6之间有极显著性增大，pH低于5 时，Caco-2 细胞跨膜电阻值有明显下降。表明羟基红花黄色素A 在Caco-2 单层细胞模型的渗透性与pH 有关，见图1。

图1 不同PH 的200μg·ml-1 Hya对Caco-2 转运的影响

图2 不同浓度的Hya对Caco-2 细胞转运和摄取的影响

(二)浓度对羟基红花黄色素A 细胞转运和摄取的影响。当pH6 时，AP→BL方向转运在100～800μg·ml-1的浓度范围内，Papp 无显著性差异，即无浓度依赖性。表明在100～800μg·ml-1的浓度范围内羟基红花黄色素A 以被动扩散为主。在同一浓度范围内，BL→AP方向转运的表观渗透系数Papp 在整个浓度范围内也无显著性变化。在100～800μg·ml-1的浓度范围内，Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)在0．59～1．10之间，表明羟基红花黄色素A 在BL→AP与AP→BL方向转运速度是接近的(图2)。摄取实验中，在100～800μg·ml-1 的浓度范围内，BL→AP方向的细胞内对羟基红花黄色素A 的滞留量极显著性大于AP→BL方向(图2)。

(三)维拉帕米对羟基红花黄色素A 细胞转运和摄取的影响。在供试液和接收液中含100μmol·L-1维拉帕米时，200μg·ml-1羟基红花黄色素A 的表观渗透系数BL→AP与AP→BL方向均极显著性增加，增加的比例相似。摄取实验中BL→AP的细胞内对羟基红花黄色素A 的滞留量极显著性增加。而AP→BL方向的细胞摄取无显著性变化(图3)。

图3 维拉帕米羟基红花黄色素A 细胞转运和摄取的影响

(四)低钠介质与BSO对羟基红花黄色素A 细胞转运的影响。含200μg·ml-1羟基红花黄色素A 供试液和接收液中的Na+浓度降低到20μmol·L-1(用K+调节至等渗)，羟基红花黄色素A 的表观渗透系数显著性降低(Figure10)。当200μg·ml-1羟基红花黄色素A 供试液和接收液中加入500μmol·L-1BSO 时，羟基红花黄色素A 的表观渗透系数无显著性变化(图5)。

图4 低钠介质与BSO对羟基红花黄色素A 细胞转运的影响

四、讨论

常用中药红花为菊科一年生草本植物红花的干燥管状花，始载于《开宝本草》，在我国已有两多年的栽培与用药历史，具有活血去瘀、通经止痛之功效。红花中羟基红花黄色素A(简称羟基红花素)是红花主要的活性成分，是查耳酮类化合物，具有扩张冠脉、抗氧化、保护心肌等多种药理学功效。目前其临床剂型为注射剂，其口服吸收程度及具体的吸收机制还不明确。研究羟基红花素的口服剂具有重要的临床意义。

体外模型被广泛用于阐明药物分子的转运机制以及确定某些影响药物转运特性的结构特征。在本研究中采用了不同介质PH 值、浓度、维拉帕米、低Na 介质、丁硫氨酸亚砜胺(BSO)对羟基红花黄色素A 在Caco -2 细胞单层的转运和摄取的影响。实验结果显示，在pH7．4～pH4 范围内，羟基红花黄色素A AP→BL方向转运的表观渗透系数有显著性增大，在pH5～6之间有极显著性增大，表明羟基红花黄色素A 在Caco -2 单层细胞模型的渗透性与pH 有关。pH6 时，在100～800μg·ml-1的浓度范围内，Papp 无显著性差异，即无浓度依赖性。表明在100～800μg·ml-1的浓度范围内羟基红花黄色素A 以被动扩散为主。当供试液和接收液中含100μmol·L-1维拉帕米时，羟基红花黄色素A 由AP→BL方向Papp 极显著性增加，证明在AP 细胞膜上存在P-gp 外排。羟基红花黄色素A 由BL→AP方向细胞内滞留显著性增加，可能与P -gp 外排被抑制有关。当供试液和接收液中含500μmol·L-1BSO 时，羟基红花黄色素A 的Papp 在AP→BL方向无显著性变化。表明羟基红花黄色素A在肠道的吸收不受MRP2 外排的影响。当供试液和接收液中的Na+浓度从154 mmol·L-1降低到20mmol·L-1(用K+调节至等渗)时，低浓度的Na +可以导致SGLT1 活性降低，葡萄糖转运速度减慢。羟基红花黄色素A 转运速度显著性降低，表明其吸收与SGLT1 有关。

本文研究并未结合剂型因素，但若可以结合剂型因素，有望为口服羟基红花素剂型设计、处方和工艺的筛选提供依据。因此Caco-2 细胞模型在中药口服吸收研究方面具有广泛的应用前景。