张艳 李倩倩 霍薇

血管性痴呆动物模型的研究现状

张艳 李倩倩 霍薇

血管性痴呆(vascular dementia，VD)指各种脑血管病引起的获得性认知障碍，它是痴呆的重要类型，已经越来越引起重视。VD相关的实验动物模型在研究中广泛应用，包括短暂性全脑缺血模型、永久性全脑缺血模型、局灶性脑缺血模型和脑小血管病模型。本文将这些模型的制备方法、脑组织的病理学变化和认知功能损害的特点等进行综述，期望对临床和实验研究有所帮助。

血管性痴呆；动物模型

血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment，VCI)是指大脑任何血管因素引起的认知功能障碍，主要包括非痴呆性血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment no dementia，VCIND)、血管性痴呆(vascular dementia，VD)和混合型痴呆等，它可以单独发生或与Alzheimer病合并出现。为深入研究VCI/VD的发病机制、病理学改变、认知功能损害的特点和治疗措施等，研究者已经建立了多种模拟人类疾病特征的动物模型。本文将对这些动物模型的制备方法、脑组织的病理学变化和认知功能损害的特点等进行综述，期望对VCI/VD的研究有所帮助。

1 短暂性全脑缺血模型

短暂性全脑缺血模型是通过可逆性、短暂性夹闭相应脑血管，或结合动脉放血造成低血压等方法，制备的全脑缺血模型。该模型对于慢性脑缺血、VD和相关药物治疗等的研究具有实际意义。其缺点在于操作方法对动物全身状态影响较大，梗死部位不固定。

1.1 四血管法(four vessels occlusion，4-VO) 四血管法为目前国际公认的VD模型制备方法，也可用于神经保护药物的研究。操作方法：首先分离双侧颈总动脉备用，然后电凝或结扎双侧椎动脉，造成永久性闭塞。实验中可根据需要短暂地阻断双侧颈总动脉，并于一定时间后开放而实现血流再灌注。该方法常用动物为大鼠，也可为猴和兔等。Chung等[1]发现给予大鼠反复两次脑缺血再灌注，每次缺血持续10 min，间隔期为1 h，在术后第7天，经八臂迷宫实验检测到大鼠的空间工作记忆受损，表现为大鼠对食物在迷宫中的空间位置记忆错误，正确找到食物的次数减少，而错误频率增加。病理学检查见海马CA1区神经元死亡，皮层和丘脑的少突胶质细胞凋亡。而且海马和皮层的乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)释放量显著减少，ACh水平降低。经过反复3次的脑缺血再灌注后，应用八臂迷宫实验检测，发现除了导致大鼠前述的显著的空间记忆损害外，一些大鼠还会有运动功能障碍[1]。

1.2 三血管法(three vessels occlusion，3-VO) 操作方法：先分离双侧颈总动脉备用，结扎基底动脉，然后用动脉夹夹闭两侧颈总动脉，形成3条动脉阻断的全脑缺血模型。一定时间后，解除双侧颈总动脉的夹闭，血流再通即形成再灌注。常用动物为大鼠。此法可通过阻断颈总动脉的时间长短来控制脑缺血程度。Horeck等[2]通过Morris水迷宫检测，发现3-VO模型造成大鼠空间学习记忆能力的损害，与二血管法(two vessels occlusion，2-VO)的研究结果相似。因为2-VO模型鼠术后急性脑缺血比较严重，采用3-VO模型可以尽量降低急性脑缺血程度，减少对慢性脑缺血病理生理过程的干扰。

1.3 2-VO 操作方法：分离并夹闭双侧颈总动脉，使血流阻断5 min，同时从尾尖部放血(不超过1 mL/100 g体质量)，然后使血流复通。C57BL/6小鼠的后交通动脉发育不良，Yamamoto等[3]发现，采用2-VO法短暂(5 min)阻断血流，术后第7天通过被动逃避实验和Y迷宫检测，可观察到小鼠的学习功能受损，海马长时程增强作用受到抑制。2-VO(20 min)可导致海马CA1区广泛的神经元死亡。Walker等[4]发现2-VO方法还会导致脑白质损害，该作者对小鼠全脑缺血再灌注后3 d，在缺血的胼胝体和尾状核的白质纤维束，可见星形胶质细胞和小胶质细胞活化，金属基质蛋白酶2(MMP-2)的表达和活性增加，并出现少突胶质细胞死亡和髓鞘碱性蛋白缺失。

2 永久性全脑缺血模型

永久性全脑缺血模型是通过永久性结扎相应脑血管而制备的全脑缺血模型，根据操作方法分为4-VO、3-VO、2-VO和双侧颈总动脉狭窄模型等。其中2-VO是研究VD的较好动物模型。永久性全脑缺血模型的缺点是全脑缺血模型影响全身其他器官的功能，与由单一脑动脉闭塞所致的VD亚型不同。

2.1 4-VO Pulsinelli 等[5]通过阻断双侧颈总动脉及椎动脉血流成功建立了四血管闭塞法大鼠全脑缺血模型。操作方法：颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，将无损动脉夹轻放于双侧动脉周围；同时枕部切口暴露第一颈椎翼小孔，电凝双侧椎动脉，造成永久性闭塞。24 h后夹闭双侧颈总动脉，造成明显的脑缺血。Pulsinelli等四血管法大鼠全脑缺血模型被广泛采用,但也存在着易出血、椎动脉不易阻断、操作中呼吸抑制等缺点。为提高模型的可靠性，许多学者对Pulsinelli等四血管法模型做了改良。Barros等[6]通过先结扎双侧椎动脉，间隔1周后再次结扎双侧颈内动脉，制备慢性脑低灌流的4-VO模型。在术后第40天，通过被动逃避实验和Y迷宫检测，16月龄大鼠表现为轻度学习功能受损；其中部分大鼠出现皮质神经元缺血性坏死。

2.3 2-VO Farkas等[9]通过夹闭双侧颈总动脉，合并低血压以减少脑血流量，造成急性脑缺血。啮齿动物(沙土鼠除外)脑血液循环有丰富的侧支循环，仅结扎双侧颈总动脉不足以明显降低脑血流量，通过一些改良，如颈部软组织加压，或通过剪尾放血、腹腔注射硝普钠和颈总静脉处置管抽血等方法降低血压，增加模型的可靠性。于术后第7天左右，通过Morris水迷宫试验可观察到学习和记忆功能受损，大约术后8周经八臂迷宫实验也可检测到空间工作记忆受损。2-VO模型动物认知功能的损害主要是由脑白质病变引起的，包括脱髓鞘、髓鞘碱性蛋白的缺失和小胶质细胞的活化等。一般从术后4周开始，海马CA1区会出现星形胶质细胞密度增加和神经元的缺失[9]。血管病变于术后12个月出现，表现为毛细血管壁的管壁增厚和纤维化[10]。

2.4 双侧颈总动脉狭窄模型 有研究者应用线圈缩窄双侧颈总动脉，制备沙土鼠永久性全脑缺血模型[11]。在术后6周，通过被动逃避实验可观察到模型动物的记忆损害。组织学检查发现术后1周在海马、基底节和大脑皮质存在局灶性神经元缺失(直径约1 mm)，并伴有胶质增生；在术后8周，出现弥漫性白质损害，其特征为白质稀疏，不伴有局部缺血改变的胶质增生，髓鞘碱性蛋白和轴索纤维减少。Nishio等[12]使用弹簧圈缩窄小鼠的双侧颈总动脉，造成永久性脑低灌注。由于该小鼠额叶-皮质下环路受损，不伴有明显的灰质改变，表现为工作记忆障碍，类似于皮质下VD。参考记忆和工作记忆的损害出现于术后5～6个月。在术后8个月，组织学分析可见海马萎缩，有细胞皱缩和凋亡。Miki等[13]选择C57BL/6小鼠外置弹簧圈制备双侧颈总动脉狭窄模型，在轻度脑低灌注组(脑血流量降低至术前的30%～50%)，小鼠表现为快速移动行为和空间参考记忆障碍。在术后5周，组织学分析可见脑白质疏松，并有小坏死灶，伴随反应性星形胶质细胞增生、小胶质细胞浸润、轴突缺失和髓鞘崩解，在左侧大脑半球病变更为明显。

3 局灶性脑缺血模型

局灶性脑缺血模型模拟了人类永久性脑梗死的病理生理过程，梗死灶固定，重复性好，对于VD的研究具有重要意义。其缺点是该模型在梗死部位、梗死体积和病变严重程度等方面均与人类脑卒中存在差异，且动物术后可能出现严重偏瘫症状，从而影响行为学的检测。

3.1 线栓法 1986年Koizumi等首次报道了不用开颅的大鼠大脑中动脉可逆性阻断模型的制备方法，即大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。操作方法：分离一侧颈总动脉，由颈外动脉残端插入一顶端粘有硅橡胶的尼龙单丝线，至颈内动脉颅内分叉部时可阻断流入大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)的血流。1989年Zea-Longa等以顶端烫成光滑圆球的4-0尼龙单丝线，由颈总动脉分叉处切口导入，也制成相似的模型。在大鼠和小鼠，单侧的MCAO模型可以产生局灶性缺血灶，受累区域包括皮质、尾状核和皮质下白质，引起对侧的运动感觉功能障碍。Roof等[14]发现在永久性大鼠MCAO模型，当阻塞部位在MCA近端时，损害纹状体和皮质，表现为学习和记忆功能受累，定位航行实验异常，肢体放置反应和姿势反射均受累。MCA远端阻塞的大鼠，仅导致皮质损害，出现运动感觉功能障碍，2周后基本恢复，定位航行实验正常。小鼠MCAO模型表现出的认知功能改变差异很大，主要是与性别、种属和缺血的持续时间有关。Bou⊇t等[15]利用瑞士小鼠制备MCAO模型(短暂性缺血30 min)，发现小鼠在术后1个月存在运动感觉功能障碍，Morris水迷宫实验检测正常，但是被动逃避实验表现出学习能力障碍，主要是由于皮质和纹状体受累导致。

3.2 内皮素注射法 脑内立体定向注射内皮素-1，利用其血管收缩作用，可逆性阻断MCA的血流，诱发短暂性、局灶性脑缺血，形成局灶性脑梗死。单侧纹状体注射内皮素的动物，在2周时出现前肢不对称和运动功能受损[16]。目前对该模型还没有认知功能检测的数据。

3.3 栓塞法 采用<200 μm的同种大鼠(家兔或猴)血凝块栓子悬液，由颈外动脉注入栓子后将颈外动脉结扎，开放颈总动脉，使栓子自颈内动脉进入颅内的各动脉，造成多处小梗死灶(直径约1 mm)或较大的区域性梗死。栓子来源也可以是悬浮的胆固醇结晶、塑料微粒或琼脂糖微粒等。实验动物主要表现为学习能力受损[17]。

通过血管内注射光化学诱导剂，然后用特定冷光源照射头颅局部，激发光化学反应，使血管内皮细胞破坏，血管内血栓形成，进而形成血栓-栓塞过程，导致脑梗死。术后第2天，通过Morris水迷宫实验可观察到学习能力受损，经过大约5周时间可能恢复正常。病变主要在大脑皮质，也可累及海马、基底节和皮质下白质[18]。

3.4 高血压病动物模型 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat)是具有持久性血压升高的大鼠品系，自发性高血压脑卒中倾向大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rat)是其中一个重要亚系。在自发性高血压脑卒中倾向大鼠亚系中，随鼠龄增加血压逐渐升高，并且出现脑萎缩、神经元缺失和胶质增生，与人类高血压所导致的脑损害类似。在自发性高血压大鼠的大脑皮质和基底节区，还能够观察到大小不等的出血病灶。自发性高血压大鼠伴有胆碱能系统传递功能障碍，还表现为多巴胺能神经元功能减低和去甲肾上腺素能功能亢进，类似于注意缺陷-多动障碍的疾病特征。通过被动逃避实验和Y迷宫检测，发现该模型鼠存在学习和记忆功能障碍[19]。

通过外科手术缩窄胸主动脉制备猕猴慢性高血压模型[20]。在术后12个月，猕猴开始出现认知功能减退，表现为短期记忆损害，注意力和执行功能障碍。认知功能障碍的严重程度与收缩压和舒张压的水平相关。脑内病变主要是形状不规则的小梗死灶(直径<500 μm)，伴有胶质增生，病灶散在于大脑皮质的灰质和白质、脑干和小脑，在前脑的白质区尤为明显。

4 脑小血管病(cerebral small vessel diseases，CSVD)的动物模型

CSVD发病率日益增加，约占脑卒中的25%。其临床表现主要是卒中(深部小梗死、脑出血)，认知和情感障碍，锥体外系症状、步态和排尿异常等，是导致VCI/VD的主要原因之一。为了研究高同型半胱氨酸[21]、Notch3基因突变[22]、M5R基因突变、糖尿病、脑淀粉样血管病和老龄(如大鼠鼠龄≥12个月)等单一因素对脑血管结构和功能的影响，以及在CSVD发病机制中的作用，研究者们复制了相应的各类动物模型，如高同型半胱氨酸血症模型、CADASIL模型(Notch3转基因鼠)、M5R-/-转基因鼠、糖尿病大鼠和小鼠、脑淀粉样血管病动物模型和衰老动物模型等，模拟了这些致病因素对人类疾病的影响。虽然没有一种模型可以涵盖人类CSVD的所有特征，但可以根据研究的内容合理选择有效的动物模型，为深入研究CSVD提供了可行的方法。

总之，选择合适的动物模型是进行医学研究的前提，由于临床研究的种种限制，动物模型已成为研究VD发病机制、病理学改变、认知功能损害特点和防治措施等的有效工具。VCI概念的范畴包括了VCIND、VD和混合型痴呆，目前还没有一种最适宜的VCI动物模型。从前述内容可见，制备方法不同的VD动物模型，病理组织学改变和认知功能损害程度也有所不同，研究者应该针对VCI的亚型和研究目标做出相应的选择。

[1]Chung Eh, Iwasaki K, Mishima K, et al. Repeated cerebral ischemia induced hippocampal cell death and impairments of spatial cognition in the rat[J]. Life Sci, 2002, 72(4-5): 609-619

[3]Yamamoto Y, Shioda N, Han F, et al. Nobiletin improves brain ischemia-induced learning and memory deficits through stimulation of CaMKⅡ and CREB phosphorylation[J]. Brain Res, 2009,1295: 218-229.

[4]Walker EJ, Rosenberg GA. Divergent role for MMP-2 in myelin breakdown and oligodendrocyte death following transient global ischemia[J]. J Neurosci Res, 2010,88(4): 764-773.

[5]Pulsinelli WA, James B, Brierley M. A new mode of bilateral ischemia in the unanesthetized rat[J] . Stroke, 1979, 10(3): 267-272.

[6]Barros CA, Ekuni R, Moro MA, et al. The cognitive and histopathological effects of chronic 4-vessel occlusion in rats depend on the set of vessels occluded and the age of the animals[J]. Behav Brain Res, 2009, 197(2): 378-387.

[8]de la Torre JC, Butler K, Kozlowski P, et al. Correlates between nuclear magnetic resonance spectroscopy, diffusion weighted imaging, and CA1 morphometry following chronic brain ischemia[J]. J Neurosci Res, 1995, 41(2): 238-245.

[9]Farkas E, Donka G, de Vos RA, et al. Experimental cerebral hypoperfusion induces white matter injury and microglial activation in the rat brain[J]. Acta Neuropathol, 2004, 108(1): 57-64.

[10]Farkas E, Luiten PG, Bari F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat: a model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases[J]. Brain Res Rev, 2007, 54(1): 162-180.

[11]Kurumatani T, Kudo T, Ikura Y, et al. White matter changes in the gerbil brain under chronic cerebral hypoperfusion[J]. Stroke, 1998, 29(5): 1058-1062.

[12]Nishio K, Ihara M, Yamasaki N, et al. A mouse model characterizing features of vascular dementia with hippocampal atrophy[J]. Stroke, 2010, 41(6): 1278-1284.

[13]Miki K, Ishibashi S, Sun L, et al. Intensity of chronic cerebral hypoperfusion determines white/gray matter injury and cognitive/motor dysfunction in mice[J]. J Neurosci Res, 2009, 87(5): 1270-1281.

[14]Roof RL, Schielke GP, Ren X, et al. A comparison of long-term functional outcome after 2 middle cerebral artery occlusion models in rats[J]. Stroke, 2001, 32(11): 2648-2657.

[15]Bou⊇t V, Freret T, Toutain J, et al. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse[J]. Exp Neurol, 2007, 203(2): 555-567.

[16]Lecrux C, McCabe C, Weir CJ, et al. Effects of magnesium treatment in a model of internal capsule lesion in spontaneously hypertensive rats[J]. Stroke, 2008, 39(2): 448-454.

[17]Rasmussen RS, Overgaard K, Hildebrandt-Eriksen ES, et al. D-amphetamine improves cognitive deficits and physical therapy promotes fine motor rehabilitation in a rat embolic stroke model[J]. Acta Neurol Scand, 2006, 113(3): 189-198.

[18]Pratt J, Boudeau P, Uzan A, et al. Enoxaparin reduces cerebral edema after photothrombotic injury in the rat[J]. Haemostasis, 1998, 28(2): 78-85.

[19]Tayebati SK, Tomassoni D, Amenta F. Spontaneously hypertensive rat as a model of vascular brain disorder: microanatomy, neurochemistry and behavior[J]. J Neurol Sci, 2012, 322(1-2): 241-249.

[20]Moore TL, Killiany RJ, Rosene DL, et al. Impairment of executive function induced by hypertension in the rhesus monkey (Macaca mulatta) [J]. Behav Neurosci, 2002, 116(3): 387-396.

[21]Hansrani M, Stansby G. The use of an in vivo model to study the effects of hyperhomocysteinaemia on vascular function[J]. J Surg Res, 2008, 145(1): 13-18.

[22]Joutel A, Monet-Leprêtre M, Gosele C, et al. Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease[J]. J Clin Invest, 2010, 120(2): 433-445.

(本文编辑：邹晨双)

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.016

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521255)

150001 哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科

张艳，Email：zhangyanhyd@hotmail.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)01-0067-04

2014-04-15)