综 述

循环miR-208在心血管疾病中的价值探索

1 前言

自从1954年发现天冬氨酸转氨酶活性在急性心肌梗死患者血清中升高以来，已经有越来越多的心脏标记物被发现，并在心脏病的诊断、治疗和预测中发挥着至关重要的作用。近年来发现细胞可通过分泌形式使微小RNA（miRNA）进入外周血并在外周血中稳定存在，因而使其具有潜在诊断疾病的意义。随着miRNA在心脏发育及心血管疾病发生发展中功能的逐步阐明，加之miRNA检测手段的不断成熟，人们开始将目光转向了心血管疾病miRNA标志物的发掘，并很快取得了一定的进展。研究发现 miRNA（miR-208a、miR-208b）特异性地表达于心脏，但其是否在急性心肌梗死患者的早期外周血中就有升高及这种升高是否具有诊断意义近几年才得到大量学者的注意。2009年Naoharu课题组首次将miRNA作为生物标记物引入心血管疾病的诊断邻域，之后国内外研究者相继报道了有关急性心肌梗死（AMI）循环miRNA的诊断研究。结果显示，循环 miR-499、miR-208a、miR-208b 在早期心肌缺血后即刻升高，诊断效能优于目前临床常用的心肌缺血生物标记物，如超敏心肌肌钙蛋白T highsensitivity cardiac troponin T，hs-cTnT）、肌钙蛋白（cardiac troponin，cTn）、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白等[1-3]。所以miRNA的发现为临床早期诊断心血管疾病提供了一个全新的思路，为更进一步揭示心血管疾病的病理生理过程提供了新的研究途径。

2 MiR-208的生物学效应

MiRNA是小的、内源性转录产物，是基因表达的调控者，在真核生物中普遍存在[4]。其作为一种微型调节分子，在转录水平调控蛋白质的表达，进而参与几乎所有生命体的生理和病理过程。这些长20～24个核苷酸（nt）的RNA基因主要位于蛋白质编码基因的内含子区和基因间隔区，主要由RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）转录，也有一些由RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）转录，它们可调节许多生理过程，包括细胞增殖、分化、凋亡和发育[5-7]。编码miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的辅助下形成3′polyA尾及5′加帽的初级miRNAs（pri-miRNA），并伴有蛋白编码基因合成。随后pri-miRNA折叠成具有独特发夹的二级结构，这些发夹是pri-miRNA的特异性结构，凭此可与细胞核中其他RNA相区别。这种结构可被一种微型处理复合体识别和剪切，该复合体由核糖核酸酶Drosha（核糖核酸酶Ⅲ/RNaseⅢ）、RNA结合蛋白DGCR8和其他蛋白质构成[8,9]。剪切后得到一段长约60 nt的茎-环状的前体miRNA（pre-mi RNA）[9]，pre-miRNA通过GTP依赖性核质/细胞质转运蛋白Exprotin-5从核膜转运至胞质[10]。PremiRNA进入细胞质后被核糖核酸酶Dicer（另一种RNaseⅢ）切割形成19～24 nt的双链成熟miRNAs。

MiR-208是由2个成员构成的高度保守的miRNA家族，称为miR-208a和miR-208b。两者具有极为相似的核苷酸序列[11]。2009年以前认为miR-208只由单独的一个成员构成，直到2009年该家族中另外一个成员才被发现，至此miR-208被重新命名为miR-208a，新成员命名为miR-208b[12]。后来，另一种称为miR-499的miRNA基于其序列同源性和组织表达形式的相似性也被纳入该家族当中。MiR-208a在心脏中通过Myh6基因的第29号内含子编码并表达，miR-208b则通过Myh7基因的第37号内含子编码并在心脏和骨骼肌中表达[12]。该家族的第3号成员miR-499由与前者紧密相关的基因Myh7b的第19号内含子编码。这三种miRNAs（miR-208a、miR-208b、miR-499）依次控制着心脏的肌球蛋白容量、肌纤维和肌肉性能[13]。在啮齿类动物，miR-208b在胚胎心脏中大量表达，直到成年它的表达水平下降；相反，miR-208a在心脏的发育期只处于低表达水平，而在成年后成了主要的表达基因。从胚胎期miR-208b的表达到出生后miR-208a表达的转换表明，miR-208a和miR-208b以相同的mRNAs为靶点，只是在不同的发育时期表现不同而已[14]。这清楚地揭示，miR-208b通过缓慢激活和快速抑制的肌纤维基因程序在心肌纤维特性的表达中起着关键性的作用。

3 MiR-208与心血管疾病的关系

最新研究表明，miRNA可稳定存在于人类血液、唾液、尿液等体液中，作为生物标志物用于肿瘤、肌肉损伤、炎症疾病等多种疾病[15,16]。MiRNAs是多种疾病调节因子，在心血管疾病中的作用也越来越被研究者重视。特别是在miRNAs与动脉粥样硬化斑块的形成、心梗后血管再生与miRNAs的病理生理机制，miRNAs参与心肌重构的发生发展方面吸引了很多目光。2007年Van Rooij鉴定出心脏特异表达的miRNA——miR-208。研究表明，在心脏中miR-208a的表达不仅仅受发育调节，并且在一些病理过程中将丧失这种调节。心肌的收缩性依赖于MHC两种亚型即a-MHC和b-MHC的表达，两者比例的变化将导致心肌过度肥大、纤维化和对心脏收缩功能的严重影响。的确，心肌中b-MHC表达的增加是心肌肥厚和心衰的共同特征，最终将导致心输出量的降低和造成终末期心衰微弱的收缩功能。在成人心脏中，机械应激和甲状腺功能减退都可诱发a-MHC亚型到b-MHC亚型的转换[9]。

在小鼠中miR-208a基因的丢失可导致大量快骨骼肌收缩蛋白基因的显著表达，而这些基因在正常情况下是不表达的。通过对Med13（也被称为THRAP1）的直接抑制可诱导这种骨骼肌基因序列的激活。Med13是一种甲状腺激素胞核受体。在成人心脏中Med13参与甲状腺激素的信号传导以此来抑制b-MHC的表达。然而在心脏，miR-208a的过度表达将造成Med13的显著表达从而导致b-MHC表达的增加。所以，miR-208a高水平的表达与小鼠心脏的心率不齐、心肌纤维化和肥大性生长相关，并与扩张型心肌病患者的不良临床后果也具有一定相关性。因此，miR-208a的高水平表达可作为心脏性死亡和心衰的有力预测因子[17]。另一方面研究表明，miR-208b与心肌纤维、心肌肥厚、心力衰竭和心肌缺血形成有关[18]。王大志课题组的研究发现，miR-208家族的两个亚型miR-208a和miR-208b分别由位于α亚型肌球蛋白重链和β亚型肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain）基因的内含子编码，并且miR-208a与α亚型肌球蛋白重链之间存在协同表达；同时证明miR-208a通过靶向作用于GATA结合蛋白4（GATA4），调节心脏转录因子的表达，进而在心肌肥厚性增长和心脏传导系统中发挥重要调节作用[19]。2009年8月，Naoharu课题组以大鼠为研究对象，芯片分析大鼠各组织miRNA的表达谱，确定miR-208特异性表达于心脏，并实验验证该miRNA是否能作为心肌损伤的诊断标志物。结果发现，正常大鼠血浆检测不到miR-208，异丙肾上腺素处理后明显升高，3 h达到峰值，24 h后明显下降，但仍然保持较高水平，与cTnI的变化呈现良好的相关性。此外研究人员发现，在肾梗模型、双肾切除和心肌肥大模型大鼠的血浆中检测不到miR-208，进而证明miR-208作为心肌损伤的特异性标志物，不会受到非特异性损伤的干扰，也不受肾功能的影响[20,21]。也有研究表明，体外采用大鼠H9c2细胞，用TritonX-100破坏大鼠H9c2细胞，观察细胞培养液中miR-208b的变化趋势和表达量改变，发现随着TritonX-100浓度的增加，大鼠H9c2心肌细胞坏死数量增加，细胞上清液miR-208b含量增加，心肌细胞坏死数量与细胞上清液miRNAs含量呈正相关，从而揭示急性冠脉综合征（ACS）患者血浆miR-208b可以从受损心肌细胞释放入血，导致血浆中相应表达水平变化，miR-208b可能作为ACS患者诊断及急性心梗和心衰鉴别诊断的敏感指标。

4 MiR-208与AMI的早期诊断

以往研究提示，循环miRNA可能是在磷脂双分子膜的保护下，以分泌体或微小泡的形式稳定存在于血浆中，从而可耐受诸如反复冻融、极端pH（pH 1～13），以及核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶处理3 h；与此同时，试剂盒的逐渐推广大大简化了循环miRNA的提取步骤，这些都使那些易在血浆中检出的心脏特异性miRNA得到更多的关注[22]。另一方面，目前临床所应用的AMI实验室标记物在患者症状发作后的4 h内并不是持续升高，这就需要反复检测，阻碍了AMI早期诊断[23]。鉴于AMI起病急、发病率高和病死率高等特点，早预防、早诊断，以及科学的评估预后控制其发生发展显得尤为重要。因此，深入研究新的具有高诊断效能的实验室标记物不仅具有学术价值，更具有应用前景。

Devaux等[24]选取了胸痛发作＜12 h，确诊AMI的510例患者作为试验组，其中ST段抬高心肌梗死（STEMI）397 例，非 STEMI（NSTEMI）113 例；对照组选取87名健康志愿者。就诊后即刻采血、离心提取血浆，检测miRNA。研究发现，所有AMI患者的miR-208b较对照组显著升高（＞105倍），并且在对照组中几乎检测不到。进一步研究发现，STEMI患者的miR-208b较NSTEMI患者显著升高（＞8倍），差异有统计学意义。另一方面，miR-208b与传统AMI标记物具有显著相关性，其中与hs-cTnT初始浓度呈正相关。为了进一步确认miR-208a作为心梗标志物的特异性，Qing研究组检测了急性肾损伤8例）、慢性肾功能衰竭（11例）、卒中（11例）、外伤（9例）患者血浆中该miRNA的含量，结果在这些患者中均检测不到循环miR-208a的存在。这提示miR-208a是一个诊断急性心梗更为可靠的生物标志物。为了验证miR-208a是否能够更早反映急性心梗的发生，他们检测了急性心梗患者胸痛发生早期（3例）血浆中的miR-208a，发现该miRNA能够比cTnI更为快速（1～4 h）地反映急性心梗的发生。对急性心梗患者（5例）治疗（经皮冠状动脉介入治疗和常规药物治疗）出院后的2个月随访发现，血清中检测不到miR-208a的存在。而需要指出的是，动物学实验表明，冠状动脉结扎1 h后血浆miR-208a含量便开始升高，3 h达峰值，6～12 h开始下降，24 h恢复到检测不到的水平[25]。这提示，miR-208a同样对心梗临床治疗效果的评估及预后意义可能不是很大，miR-208a可能更适用于早期诊断[26]。

5 展望

越来越多的研究显示，AMI发生后心脏特异性循环miRNA表达明显升高，其诊断效能不俗。这门新兴的研究日趋成熟，并且更为经济的检测技术也在不断开发中。国外已有研究报道，可以检测AMI患者尿中miRNA的含量变化做出诊断，从而使检测技术更加简单化。深入研究心脏特异性循环miRNA在AMI诊疗评估体系中的作用，协同目前临床应用ACS风险评估，例如GRACE和HEART评分系统，更是具有重大的临床意义。有理由相信在不久的将来，心脏特异性循环miRNA将很有可能成为AMI新型实验室标记物。

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The value exploration of circulation miR-208 in cardiovascular disease

张一凡 谢莲娜 司瑞 郭文怡

微小RNA； 心血管疾病； 急性心肌梗死； 早期诊断

MicroRNA； Cardiovascular disease； Acute myocardium infarction； Early diagnosis

116001 辽宁省大连市，大连大学附属中山医院循环四科

谢莲娜，E-mail：xieln1963@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．08．002

R54

A

1672-5301（2015）08-0678－04

2015-04-08）