李军　潘艳　陈泽祥　等

摘要：应用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法分析羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域；应用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法和Jameson-Wolf法分析蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数。对各方法的结果综合分析，VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸区域可能是优势B细胞抗原表位。

关键词：布鲁氏菌；VirB8；抗原表位

中图分类号：S858.26；S852.61+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5467-03

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种以人和动物出现流产、不育和发热为临床特征的人兽共患细菌病，在中国人、畜间仍有该病的发生，给人类健康和畜牧业的发展带来严重危害[1]。布鲁氏菌是一种兼性细胞内寄生的细菌，动物感染后常呈隐性，往往到性成熟或妊娠时才表现典型的临床症状，对布鲁氏菌早期感染的检测是有效防控布鲁氏菌病的关键。现在用于布鲁氏菌病检测的主要方法是虎红平板凝集（RBT）和试管凝集试验（SAT），但其存在着灵敏度低和非特异性的缺点，因此，建立一种敏感性高、特异性强的ELISA方法具有重要的意义。

VirB8蛋白是布鲁氏菌IV型分泌系统的一个早期分泌蛋白[2]，钟旗等[3]的研究表明，缺失VirB8基因的猪种布鲁氏菌变异株感染BALB/c小鼠后，可保护小鼠抵抗亲本细菌的攻击，证实VirB8基因与布鲁氏菌毒力密切相关。VirB8基因同源性比较表明，其在布鲁氏菌种间的同源性高度保守[4]，因此，VirB8基因可以作为布鲁氏菌基因缺失疫苗、鉴别诊断方法的一个靶基因。张剑等[5]对牛种布鲁氏菌VirB8基因进行原核表达后，以表达的蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法与虎红平板凝集试验的符合率达97.02%，证明了以VirB8蛋白作为包被蛋白建立间接ELISA的可行性。但是，原核表达蛋白存在着蛋白纯化、生产成本高等缺点，而以抗原表位序列为基础的人工合成抗原多肽有效解决了这些问题。本研究拟对羊种布鲁氏菌VirB8蛋白的B细胞抗原表位进行分析，为后续VirB8蛋白的抗原多肽合成提供信息。

1 材料与方法

1.1 羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8基因序列

羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8基因序列为本实验室扩增、测序所得[4]。基因序列已经登录NCBI GenBank，登录号JQ768413。以此基因的推导氨基酸序列为研究对象进行VirB8蛋白的B细胞抗原表位分析。

1.2 VirB8蛋白二级结构分析

应用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析VirB8蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域[6，7]。

1.3 VirB8蛋白B细胞抗原表位分析

运用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析VirB8蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数，综合各方法的结果并结合B细胞表位网上VirB8蛋白的B细胞抗原表位预测进行综合分析[8-11]。

2 结果与分析

2.1 VirB8蛋白二级结构分析

综合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析，VirB8蛋白有4个α-螺旋区域（25-33、36-39、41-45、64-73位氨基酸）；7个β-折叠区域（52-64、73-82、107-116、160-169、172-186、193-207、235-239位氨基酸）。在α-螺旋和β-折叠区域的间隙分布着长短不一的9个转角区域和11个卷曲区域（图1）。

2.2 VirB8蛋白的氨基酸亲水性分析

Kyte-Doolittle方法（图2）分析表明，VirB8蛋白有2-22、37-45、93-97、116-127、135-158、181-196、229-233等7个氨基酸亲水性区域（≥0.5）。

2.3 VirB8蛋白的柔性区域分析

Karplus-Schulz方法（图3）分析表明，VirB8蛋白有多个柔性区域，主要位于4-22、38-43、79-87、89-96、115-116、123-127、134-142、144-162、169-178、182-196、213-221和231-235位氨基酸区域。

2.4 VirB8蛋白的溶剂表面可及性分析

Emini方法（图4）分析表明，3-16、39-43、91-97、100-107、115-127、134-141、145-155、181-195和229-232位氨基酸区域出现在VirB8蛋白溶剂表面可及性较大（≥1）。

2.5 VirB8蛋白的抗原指数分析

Jameson-Wolf方法（图5）分析表明，VirB8蛋白抗原指数较高的区域（≥0）有：1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸区域，以C端区域的抗原指数较高，跨度较大，存在抗原表位的可能性也较大。

2.6 VirB8蛋白B细胞表位综合分析

应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并结合B细胞表位网上预测分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/），VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸区域具有较好的亲水性、柔性和溶剂表面可及性，抗原指数也较高，结合蛋白二级结构上含有容易形成抗原表位的转角和卷曲区域，因此，这些区域极有可能是VirB8蛋白的优势B细胞抗原表位。

3 讨论

布鲁氏菌IV分泌系统是由VirB1—VirB12共12个蛋白构成的一类分泌系统。布鲁氏菌侵入宿主吞噬细胞后，VirB蛋白在布氏小体运输到网状内皮系统的过程中，能阻止溶酶体与布氏小体的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作为一种布鲁氏菌早期分泌蛋白，可以是布鲁氏菌病早期诊断的靶蛋白。在布鲁氏菌病诊断中，传统的RBT和SAT方法的灵敏度低，特异性不强。1976年，Carlesson HE首次将ELISA方法应用于牛种布鲁氏菌病的检测，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界动物卫生组织（OIE）对布鲁氏菌病的检测方法中，已经将ELISA方法列为血清学检测方法。

通过生物信息学技术对蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行分析是人工合成多肽的基础[15]。蛋白的二级结构决定了B细胞抗原表位的形成，蛋白多肽链中的α-螺旋和β-折叠形成稳定的刚性结构，在蛋白内部中起着“支撑”作用，成为B细胞抗原表位的概率低；而转角和卷曲区域属于“柔性”结构，暴露在蛋白表面，与抗体结合的几率大，成为B细胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的亲水性、极性也决定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的亲水部位和溶剂表面可及性也与B细胞抗原表位有密切关系。

蛋白二级结构分析、氨基酸亲水性分析、蛋白柔性区域分析、溶剂表面可及性分析是目前常用的B细胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf对此进行了改良，以蛋白二级结构分析占40%、氨基酸亲水性分析占30%、蛋白柔性区域分析占15%、溶剂表面可及性分析占15%的计算模式，提出一种抗原指数分析法[11]。根据该方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸区域存在抗原表位的可能性较大，但由于蛋白在形成立体构象时，蛋白表面的氨基酸会遮盖一些抗原指数较高的区域，使其不能成为优势抗原表位，因此，根据综合分析，人们选择VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸区域作为后续多肽抗原研究的靶位点。

参考文献：

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].第五版.北京：中国农业出版社，2006.

[2] ROUOT B， ALVAREZ-MARTINEZ M T， MARIUS C. Production of the type IV secretion system differs among Brucella species as revealed with VirB5-and VirB8-specific antisera [J]. Infection and Immunity， 2003， 71： 1075-1082.

[3] 钟 旗，何倩倪，范伟兴，等.布鲁氏菌VirB8变异株的构建及其感染力和毒力的测定[J].畜牧兽医学报，2009，40（6）：892-897.

[4] 李 军，陈泽祥，杨 威，等.广西家畜布鲁氏菌病的监测分析[J].中国人兽共患病学报，2012，28（7）：754-758.

[5] 张 剑，马卫明，张 亮，等.牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用[J].中国农业科学，2013，46（16）：3460-3469.

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[13] NAROENI A，JOUY N，OUAHRANI-BETTACHE S， et al. Brucella suis-impaired specific recognition of phagosomes by lysosomes due to phagosomal membrane modifications[J]. Infect Immun，2001，69（1）：486-493.

[14] CARLESSON H E， HURVELL B， LINDBERG A A. Enzyme-linkerd immunosorbent assay for titration of antibodies against Brucella abortus and Yersinia enterocolitica[J]. Acta Pathol Microbiol Scand C， 1976， 84（3）： 168-176.

[15] 张洪勇，金宁一.合成肽疫苗的分子设计[J].生物技术通讯，2003，14（2）：145-147.

[16] 来鲁华.蛋白质的结构预测与分子设计[M].北京：北京大学出版社，1993.

（责任编辑 程碧军）

3 讨论

布鲁氏菌IV分泌系统是由VirB1—VirB12共12个蛋白构成的一类分泌系统。布鲁氏菌侵入宿主吞噬细胞后，VirB蛋白在布氏小体运输到网状内皮系统的过程中，能阻止溶酶体与布氏小体的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作为一种布鲁氏菌早期分泌蛋白，可以是布鲁氏菌病早期诊断的靶蛋白。在布鲁氏菌病诊断中，传统的RBT和SAT方法的灵敏度低，特异性不强。1976年，Carlesson HE首次将ELISA方法应用于牛种布鲁氏菌病的检测，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界动物卫生组织（OIE）对布鲁氏菌病的检测方法中，已经将ELISA方法列为血清学检测方法。

通过生物信息学技术对蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行分析是人工合成多肽的基础[15]。蛋白的二级结构决定了B细胞抗原表位的形成，蛋白多肽链中的α-螺旋和β-折叠形成稳定的刚性结构，在蛋白内部中起着“支撑”作用，成为B细胞抗原表位的概率低；而转角和卷曲区域属于“柔性”结构，暴露在蛋白表面，与抗体结合的几率大，成为B细胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的亲水性、极性也决定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的亲水部位和溶剂表面可及性也与B细胞抗原表位有密切关系。

蛋白二级结构分析、氨基酸亲水性分析、蛋白柔性区域分析、溶剂表面可及性分析是目前常用的B细胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf对此进行了改良，以蛋白二级结构分析占40%、氨基酸亲水性分析占30%、蛋白柔性区域分析占15%、溶剂表面可及性分析占15%的计算模式，提出一种抗原指数分析法[11]。根据该方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸区域存在抗原表位的可能性较大，但由于蛋白在形成立体构象时，蛋白表面的氨基酸会遮盖一些抗原指数较高的区域，使其不能成为优势抗原表位，因此，根据综合分析，人们选择VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸区域作为后续多肽抗原研究的靶位点。

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（责任编辑 程碧军）

3 讨论

布鲁氏菌IV分泌系统是由VirB1—VirB12共12个蛋白构成的一类分泌系统。布鲁氏菌侵入宿主吞噬细胞后，VirB蛋白在布氏小体运输到网状内皮系统的过程中，能阻止溶酶体与布氏小体的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作为一种布鲁氏菌早期分泌蛋白，可以是布鲁氏菌病早期诊断的靶蛋白。在布鲁氏菌病诊断中，传统的RBT和SAT方法的灵敏度低，特异性不强。1976年，Carlesson HE首次将ELISA方法应用于牛种布鲁氏菌病的检测，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界动物卫生组织（OIE）对布鲁氏菌病的检测方法中，已经将ELISA方法列为血清学检测方法。

通过生物信息学技术对蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行分析是人工合成多肽的基础[15]。蛋白的二级结构决定了B细胞抗原表位的形成，蛋白多肽链中的α-螺旋和β-折叠形成稳定的刚性结构，在蛋白内部中起着“支撑”作用，成为B细胞抗原表位的概率低；而转角和卷曲区域属于“柔性”结构，暴露在蛋白表面，与抗体结合的几率大，成为B细胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的亲水性、极性也决定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的亲水部位和溶剂表面可及性也与B细胞抗原表位有密切关系。

蛋白二级结构分析、氨基酸亲水性分析、蛋白柔性区域分析、溶剂表面可及性分析是目前常用的B细胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf对此进行了改良，以蛋白二级结构分析占40%、氨基酸亲水性分析占30%、蛋白柔性区域分析占15%、溶剂表面可及性分析占15%的计算模式，提出一种抗原指数分析法[11]。根据该方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸区域存在抗原表位的可能性较大，但由于蛋白在形成立体构象时，蛋白表面的氨基酸会遮盖一些抗原指数较高的区域，使其不能成为优势抗原表位，因此，根据综合分析，人们选择VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸区域作为后续多肽抗原研究的靶位点。

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（责任编辑 程碧军）