邓文　郭冬各　于翠　等

摘要：利用选择性培养基，对不同施肥桑树根际解有机磷细菌进行分离、筛选，并采用Biolog自动微生物系统进行鉴定，分析不同施肥桑树根际解有机磷细菌的数量和多样性及土壤养分含量的变化。各施肥处理分离到的菌属主要包括贪噬菌属、气单胞菌属、芽胞杆菌属、假单胞菌属和伯克氏菌属等。施用3 000 kg/hm2桑树专用有机-无机复混肥（TA）处理的土壤中解有机磷细菌数量、种群结构、Shannon-Wiene多样性指数（H）和丰富度（S）均高于其他施肥处理。TA处理可提高土壤有机质、速效氮、速效磷和速效钾含量。相关性分析表明，TA处理土壤中解有机磷细菌数量与土壤速效磷含量呈极显著正相关，相关系数为0.66；空白（CK）处理的土壤中解有机磷细菌数量与速效钾含量呈显著负相关，相关系数为-0.62。

关键词：施肥；桑树；解有机磷细菌

中图分类号：S888.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5383-04

桑树是我国重要的经济作物，合理施肥对提高桑叶的产量和品质十分重要[1，2]。在蚕桑生产中，主要通过施入化学磷肥补充桑树对磷的需求，但是桑树对磷肥的利用率很低，长期施用化学磷肥，一方面会导致大量磷素在桑园土壤中积累，造成磷资源的浪费，另一方面引起桑园土壤中各种养分的失衡，最终将会影响桑树的生长[3，4]。

植物根际解磷细菌不仅可以将难溶性磷转化为植物可以直接吸收利用的可溶性磷，提高磷肥利用率，而且对植物生长起到一定程度的促生作用。林启美等[5]报道，解磷细菌的数量受土壤类型、土壤肥力等的影响。吴凡等[6]对不同肥力条件下桑树根际微生物的种群分析表明，肥沃土壤解磷细菌的数量和种类均高于贫瘠土壤。罗明等[7]发现，有机肥与N、P、K合理配施能有效促进磷细菌的生长繁殖，提高其数量和活性。本试验分析不同施肥对桑树根际解有机磷细菌数量和种群多样性的影响，为通过合理施肥措施提高桑树对磷的吸收利用及改善桑园土壤环境提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试桑树

供试桑树品种为湖桑32号，于1996年栽植于湖北省农科院经济作物研究所桑树种质资源圃，栽植密度为0.6 m × 1 m，低中干养成。

1.2 施肥处理

2009-2014年连续施肥试验，每一种施肥处理小区按国家土壤肥力长期定位试验标准统一设置为66.7 m2。供试桑树专用有机-无机复混肥是根据桑园土壤特点及桑树对养分的基本需求研制而成，其中N、P2O5、K2O的比例为15∶4∶6，有机质质量分数为20%。供试化肥为尿素、过磷酸钙和硫酸钾镁（湖北宜化集团有限责任公司）。

4种施肥处理的方式如下所述。①按照3 000 kg/hm2的施用量施用桑树专用有机-无机复混肥（TA）；②施用与TA处理等氮的尿素，即450 kg/hm2氮素（TB）；③施用与TA处理等氮、磷、钾的复合肥，即450 kg/hm2氮素、120 kg/hm2 P2O5、180 kg/hm2 K2O（TC）；④未施肥处理（CK）。每年分别于3月份和夏伐后施肥2次，每个施肥处理4次重复，随机排列。

1.3 土样采集

分别于2012年施肥前（3月12日），夏伐前大蚕用叶期（5月18日），新梢旺长期（7月4日），新梢缓慢生长期（9月7日），新梢停长期（11月8日）采集土壤样品。每个处理随机选取5个采样点，除去表土，取桑树根部1～4 mm松散粘附于根面的土壤，装入自封袋，带回实验室。将5个采样点的土样混匀，一部分在4 ℃冰箱保存，用于解有机磷细菌分离，一部分自然风干、过筛，用于土壤理化性质分析。

1.4 桑树根际解有机磷细菌的分离、计数

采用蒙金娜有机磷培养基进行分离。每个土样称取5 g，放入盛有45 mL无菌水的100 mL三角瓶中，置于摇床上振荡约20 min，取上清液以10倍稀释法稀释至10-4、10-5、10-6稀释度，每个浓度设3个重复，28 ℃培养2～3 d后，统计具有溶磷圈的菌株数。解有机磷细菌进行划线纯化后，进行试管斜面培养用于鉴定。

1.5 桑树根际解有机磷细菌的多样性测定

参照常用细菌系统鉴定手册，在解磷细菌选择性培养基上观察解有机磷细菌菌落特征，革兰氏染色后在显微镜下观察菌体形态，对分离到的解有机磷细菌进行初步分类[8，9]。使用Shannon-Wiener多样性指数（H）、丰富度指数（S）、Pielou均匀度指数（J）和Simpson优势度指数（D）分析桑树根际土壤解有机磷细菌的种群多样性特征。多样性指数的计算公式为H=-∑Pi㏑Pi，其中Pi=Ni/N，Ni为属i单菌落的数量，N为土样中总单菌落的数量；丰富度指数为属i所在土样中的数目；均匀度指数的计算公式为J=∑PilnPi/lnS；优势度指数的计算公式为D=∑Pi2。

1.6 解有机磷细菌的Biolog自动微生物系统鉴定

将分离到的解有机磷细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上活化和纯化，挑取单菌落在BUG培养平板上划线培养，至长出单菌落，制备均匀的菌悬液，使用八通道移液器将菌悬液加入Biolog GN III鉴定板，置于33 ℃培养，在4～6 h和16～24 h分别进行读数。按可能性大小（SIM值）给出接近的种属名称，SIM值≥0.5为可接受的鉴定结果。

1.7 土壤基本理化性质分析

有机质含量测定采用重铬酸钾容量法，碱解氮含量测定采用碱解扩散法，速效磷含量测定采用碳酸氢钠浸提法，速效钾含量测定采用火焰光度法[10]。

1.8 数据统计

采用DPS v7.05版数据处理系统进行统计分析，Excel软件做图。

2 结果与分析

2.1 施肥对桑树根际土壤养分含量的影响

如表1所示，各取样时期TA处理土壤有机质、速效氮、速效钾含量均高于TB、TC及CK，且有机质和速效钾含量差异达显著水平（P<0.05）。TA和TB处理土壤速效磷含量高于TC、CK，且差异达到显著水平（P<0.05）。说明桑树专用有机-无机复混肥的施用可以提高土壤有机质、速效氮、速效磷和速效钾的积累。

2.2 施肥对桑树根际土壤解有机磷细菌数量的影响

如图1所示，土壤解有机磷细菌数量全年表现先升高后下降的趋势，各处理土壤解有机磷细菌数量均在5月18日达到最高值。TA处理在全年各取样时期解有机磷细菌数量高于其他处理（除5月18日外），且差异达到显著水平（P<0.05）。表明桑树专用有机-无机复混肥的施用能够更有效地提高桑园土壤解有机磷细菌数量。

2.3 不同施肥桑树根际解有机磷细菌种群结构

由表2可知，不同施肥处理桑树根际解有机磷细菌以革兰氏阴性菌为主，分别属于贪噬菌属、气单胞菌属、芽胞杆菌属、假单胞菌属、伯克氏菌属和产碱菌属等。与其他3种处理相比，TA处理种群结构丰富，可能是有机-无机复混肥的施用使得土壤有机物质含量丰富，从而有利于不同种类解有机磷细菌的生长繁殖。

2.4 施肥对桑树根际土壤解有机磷细菌种群多样性的影响

由表3可知，TA处理土壤解有机磷细菌种群多样性指数（H）和丰富度指数（S）均最高，而均匀度指数（J）较低，可能是由于存在争论贪噬菌和伯克氏菌属的优势菌群所致。因此，桑树专用有机-无机复混肥的施用能够提高桑园土壤解有机磷细菌的种群多样性。

2.5 解有机磷细菌数量与土壤养分的相关性分析

由表4可知，TA处理土壤解有机磷细菌数量与土壤速效磷含量呈极显著正相关，相关系数为0.66；CK处理土壤解有机磷细菌数量与速效钾含量呈显著负相关，相关系数为-0.62。说明施用桑树专用有机-无机复混肥后土壤中速效磷含量提高，桑树根际解有机磷细菌分布也增加。

3 小结与讨论

3.1 施肥与桑树根际土壤养分状况

土壤有机质包括各种动植物残体以及微生物及其生命活动所产生的各种有机物[11]，它一方面为植物的生长发育提供所需的营养元素，另一方面对形成土壤结构，改善土壤物理性状，调节土壤水分、空气、温度有重要的作用。已有研究表明，有机肥配施化肥能明显提高土壤活性有机质和总有机质的含量，使用有机肥料还能减少土壤対磷的固定，提高磷肥的有效性和利用率[12-15]。本试验结果表明，TA处理有机质含量值高于TC、TD处理及CK，这说明施用3 000 kg/hm2桑树专用有机-无机复混肥更有利于桑园土壤中有机质积累，而TB和TC处理土壤有机质含量变化差异较小，其原因有待连续多年深入研究。

土壤速效养分可被植物直接吸收利用，或在短期内能转化为植物可吸收的养分，其含量是反应土壤养分供应能力的重要指标。已有研究表明，有机-无机肥料能够减弱无机氮对土壤的酸化作用，提高土壤中速效氮、速效磷和速效钾的含量，进而提高土壤速效养分的供给能力[16-20]。本试验结果表明，施用3 000 kg/hm2桑树专用有机-无机复混肥可以提高土壤速效氮、速效磷和速效钾含量，原因可能是有机肥能够减弱土壤矿物粘粒对磷的固定，同时有机肥含有的腐植酸的官能团与钾离子结合，从而提高土壤的供磷能力和供钾能力。

3.2 施肥与桑树根际土壤解磷细菌数量及其种群结构

植物生长所必需的磷主要从土壤磷库获得，但施入的磷肥迅速转化为难以直接吸收利用的迟效态磷，影响磷素利用率的关键问题是其在土壤中的有效性，土壤中解磷细菌的数量、种类和活性标志着土壤难溶性磷转化和可被植物利用的状况[21，22]。Luo等[23]研究表明，与化肥相比，施用有机肥能够增加溶磷菌的数量。范丙全等[24]发现NPK、NPK+绿肥的施用都使土壤中解磷微生物数量降低、种类减少，可能是油菜产生的某些物质对溶磷细菌有杀死或抑制作用。本试验结果表明，3 000 kg/hm2桑树专用有机-无机复混肥的施用可提高土壤解有机磷细菌的种群多样性。因此，桑树专用有机-无机复混肥的施用不仅对维持土壤中各种养分的平衡有重要的作用，也为土壤中解磷微生物提供了有利的生长环境，而不同施肥处理对土壤解磷细菌的影响机制还有待进一步深入研究。

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