马东方+方正武+邱先进+等

摘要：中梁16具有适应性广、抗条锈性强等许多优良的生物学特性。为了给抗病育种和小麦条锈病的区域治理提供参考， 利用中国当前流行的条锈菌小种CYR29对中梁16、铭贤169及其杂交群体进行抗条锈性遗传分析， 并对其抗条锈基因进行SSR分子标记。结果表明， 中梁16对CYR29小种具有良好的抗性， 由1对显性基因控制， 暂命名为YrZh16。该基因与位于小麦2AS染色体上的5个SSR位点Xbarc124、Xbarc212、Xwmc177、Xwmc602和Xwmc827连锁， 遗传距离跨度从5.4 cM到16.9 cM。系谱分析该基因可能来自水源11。与已定位于2A染色体上暂命名抗条锈病基因的比较表明，YrZh16可能是一个抗条锈病的新基因。

关键词：中梁16；小麦条锈病；遗传分析

中图分类号：S512.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5351-04

小麦（Triticum aestivum）是一种在世界范围内广泛种植的禾本科植物，种植面积多于水稻。小麦条锈病是影响小麦生产最重要的病害之一，该病害是由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f.sp. tritici）引起的世界性病害，在低温和潮湿环境下易发生，从小麦一叶期到成熟只要植物仍然是绿色都可以发生感染[1]。该病菌可随气流高空远距离传播，具有发病范围广、流行频率高等特点。虽然农药的大面积及时使用可以控制该病害，但要投入大量的人力、物力和财力，而且污染环境。国内外大量的研究表明，培育和推广抗病小麦品种是控制这一病害最有效、经济且环保的方法[2]。然而，小麦条锈菌群体毒性结构复杂，新毒性小种不断形成，由于利用小麦抗病类型单一，促进了新生理小种的形成并发展成为优势小种，致使小麦条锈病周期性流行。因此，不断地寻找、鉴定、引进新的抗条锈病基因，并对去抗条锈的遗传特点进行研究，增加抗病基因的多样性，是控制小麦条锈病发生流行的迫切任务[3]。

至今已有51个位点上的54个抗条锈基因（Yr1～Yr54）被正式命名[4]，另外还有数十个被临时命名的基因[5]，这些基因大部分表现小种专化性。分子标记技术的发展，为抗病基因的检测、标记与定位提供了更为快捷的手段，其中SSR（Simple sequence repeat）标记在小麦抗条锈病基因定位和分子作图中被广泛应用，大部分已正式命名小麦抗条锈病基因均已获得与其紧密连锁的SSR标记。

中梁16（水源11/山前麦）是甘肃省天水市农业科学研究所选育的具有相对持久抗条锈病的冬小麦品种，综合农艺性状好。本研究旨在明确中梁16抗条锈遗传规律，挖掘其抗病基因，并获得与其紧密连锁的SSR标记，获得的分子标记将为小麦抗条锈病分子辅助育种提供有效的工具。

1 材料和方法

1.1 植物材料和条锈菌小种

用于条锈菌接菌测试的小麦品种包括：中梁16及其与铭贤169杂交后代F1、F2、F2∶3、BC1代群体。中梁16品种由甘肃省天水市农业科学研究所提供。

供试小麦条锈菌生理小种为：CYR29。菌种通过单孢分离法获得，并在中国鉴别寄主上重新鉴定确认。

1.2 苗期抗条锈病遗传分析

将亲本、F1代、F2代、BC1代以及F2∶3家系小麦种子用1∶100的双氧水溶液浸泡消毒，蒸馏水中催芽24 h，待萌发后播种到直径10 cm的小花盆中，每花盆播种15～20粒，置于温室按常规方法培养。在供试小麦幼苗第1叶片充分展开，第2叶片露尖时用手指蘸水脱去叶表面的蜡质层，同时用蒸馏水配制条锈菌夏孢子悬浮液，用接种针蘸取悬浮液涂抹于叶片正面。接种完成后，保湿24 h（黑暗、10 ℃）后转入温室内潜育发病[温度为15～17 ℃（昼）/10～12℃（夜），光照周期16 h（昼）/8h（夜）]，并采用生物镝灯增加光照强度（光强9 000 lx）。约14 d后待感病对照铭贤169充分发病时开始调查结果，反应型调查标准分为11级， 即 0、0；、0；+、1、1+、2、2+、3-、3、3+、4。其中0～2+为抗病类型， 3-～4为感病类型[6]。统计双亲、杂交后代各株系的抗感分离比例， 用卡方检验法对分离后代进行分析， 明确供试品种对特定小种抗条锈性的基因数目及基因间关系。

1.3 基因组DNA的提取和抗、感池的构建

基因组DNA提取用CTAB法[7]。参考Michelmore等[8]提出的抗、感池建立方法，将F2代群体的10株高抗单株DNA、10株高感单株DNA分别等量混合构成抗病基因池（BR）和感病基因池（BS）。构建抗感池的单株均经过F2∶3家系验证其纯合性。

1.4 SSR标记筛选和遗传作图

根据http：//wheat.pw.usda.gov公布的小麦SSR引物序列，由上海Invitrogen生命技术公司合成21条染色体上420对SSR引物。对中梁16、铭贤169、抗病基因池、感病基因池和F2代群体的DNA为模板进行扩增，筛选多态性引物。扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，硝酸银染色后显影，照相并保存图像。筛选与抗病亲本连锁的标记，进而用MAPMAKER 3.0b软件计算各标记位点与目的基因的遗传距离，最后用MapDraw V2.0软件绘制连锁图[9]。

2 结果与分析

2.1 抗条锈性鉴定

苗期接种鉴定表明，中梁16和水源11对CYR29表现良好的抗锈性，反应型为近免疫（IT 0；）。山前麦和感病对照品种铭贤169对CYR29均表现高度感病反应（IT 4）。推断中梁16的抗条锈病基因可能来自于水源11。

2.2 抗条锈性遗传分析

接种CYR29时，中梁16与铭贤169杂交的F1代15个植株均表现高抗，BC1代12株抗病，13株感病，经卡方检测符合1∶1的分离比；反交组合F2代中，抗病植株117株，感病植株44株，符合3∶1的分离比例（χ2=0.35，P=0.49），对应的F2∶3家系中，纯抗家系37个，抗感分离家系79个，纯感家系43个，分离比例符合1∶2∶1（χ2=0.46，P=0.79）（表1）。上述结果表明中梁16对CYR29的抗病性由1对显性基因控制，暂命名为YrZh16。以F2群体的161个单株构建作图群体，对抗条锈病基因进行SSR标记。

2.3 YrZh16的SSR标记定位

选择小麦21条染色体上的420对SSR引物对中梁16、铭贤169、抗病池及感病池进行多态性引物的筛选。结果2AS上的5对引物 （Xbarc124、Xbarc212、Xwmc177、Xwmc602和Xwmc827） 在中梁16、铭贤169及抗感池间能扩增出稳定的多态性片段。筛选到的5对多态性引物再对小群体进行扩增，结果显示均扩增出一致的多态性，推测这5个标记与YrZh16连锁。图1为SSR引物Xbarc177和Xbarc212在亲本、抗感池、部分F2代单株中的扩增结果。

2.4 连锁遗传分析

根据F2分离群体及F2∶3家系反应型，确定F2单株的抗感基因型。以2AS上的5对多态性引物对铭贤169×中梁16 F2代分离群体进行PCR扩增，结果显示这些位点与YrZh16有明显的连锁关系（表2）。用MAPMAKER 3.0b软件进行连锁分析， Xbarc124、Xbarc212、Xwmc177、Xwmc602和Xwmc827与抗条锈基因的遗传距离分别为13.0、5.4、6.6、9.8 和16.9 cM，总跨度为51.7 cM。参照Somers等[10]报道的小麦染色体上SSR遗传图谱， 根据YrZh16与所获得5个连锁标记之间的关系可知，YrZh16位于小麦染色体2AS上， 且位于Xbarc212和Xwmc177之间。据此绘制了中梁16中抗条锈病基因YrZh16遗传连锁图 （图2）。

3 讨论

甘肃陇南地区是中国小麦条锈病菌越夏异变区，超过80%的条锈菌新小种首先在甘肃陇南地区被发现，然后蔓延至其他地区。中梁16在陇南地区已种植多年，对稳定小麦条锈菌种群、减轻麦区菌源压力等方面有不可忽视的作用。在本试验中，课题组鉴定了中梁16对条锈菌CYR29具有良好的抗病性，并对中梁16所含的抗锈基因YrZh16进行了分子定位。本研究发现普通小麦品种中梁16对中国优势条锈菌小种CYR29由1对显性基因YrZh16控制， 被定位在染色体2AS上。

目前已报道的2AS上的抗条锈病基因有Yr17 [11]以及暂命名的QYrtm.pau-2A[12]和QTL 2AS[13]。从系谱上来说，Yr17存在于载体品种VPM1、Hyak和Madsen中，QYrtm.pau-2A存在于载体品种T.monococcum PAU14087/Kris，QTL 2AS存在于载体品种Kris/Wasmo，而YrZh16存在于中梁16（水源11/山前麦），与前者并无交集。从染色体位置来说，QYrtm.pau-2A和QTL 2AS靠近染色体端部位置，而YrZh16在染色体短臂中间位置。QYrtm.pau-2A 和QTL 2AS虽然定位在2AS染色体上，但是这两个基因均为成株期抗条锈病基因，只在成株期表达，而YrZh16为苗期抗病基因（又称全生育期抗病基因）不同。用Yr17单基因系苗期接种CYR29 的抗病性表现为中抗（IT 2），而中梁16接种CYR29的抗病性表现为近免疫。此外用CYR29接种山前麦结果表现高感，而水源11表现高抗，说明YrZh16可能来源于水源11。综合以上分析，YrZh16可能是一个与已知基因不同的新基因。

1990年中国小麦条锈病大流行，给中国小麦产量造成严重损失，有些地区小麦减产高达50%，有的甚至颗粒无收。这次条锈病大流行是由于CYR29号生理小种迅速发展（1989年其频率达40.3%）而导致大面积的种植含有抗条锈基因Yr9的“洛类”及其衍生系品种丧失抗条锈性[14]。目前，中国小麦生产上的主流品种仍然以“洛类”衍生系、繁6衍生系和扬麦系为主，它们中的大多数均感条锈病。由于小种专化抗病基因容易被新的条锈菌小种克服，在抗病育种过程中，中梁16需要与成株抗病基因以及其他全生育期抗病基因等基因聚合，以提高品种的抗病使用年限。在本研究中所明确的抗条锈病基因和获得的分子标记，对分子标记辅助育种和改良抗条锈品种具有重要意义。

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（责任编辑 罗亚军）

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