王士勇+杨月春+郑军军+刘宗岳+方大雨+杨福合��

摘要：为了观察秋水仙胺（demecolcine，DEME）诱导牛卵母细胞的显核效果，从吉林省长春市某屠宰场收集牛卵巢后采用抽吸法获取卵泡液，在体视显微镜下选择卵丘完整、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），微滴法体外成熟（invitromature，IVM）培养19～22h，在0.3%透明质酸酶中旋涡振荡去除卵母细胞周围的卵丘细胞，挑选排出第一极体的卵母细胞随机分组，分别进行DEME浓度和作用时间诱导牛卵母细胞显核的研究。结果表明，DEME处理60、90、120min组间显核率差异不显著（P>0.05），但是60、120min组的显核率显著高于DEME处理30min组（P<0.05）。当DEME浓度为0.5μg/mL时，显核率最高，为78.9%，显著高于0.3、0.4μg/mL组（P<0.05），但是与0.6μg/mL组差异不显著（P>0.05）。牛的COCs经IVM培养19、20、21、22h，结果发现培养22h组显核率最高，显著高于培养19h组（P<0.05），但是与培养20、21h组差异不显著（P>0.05）。可见牛卵母细胞经IVM培养20～22h后，用0.5μg/mLDEME处理60min可以有效诱导其显核。

关键词：地美可辛；牛；卵母细胞；体外成熟；化学辅助去核

中图分类号：S823.2文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0228-03

自1997年第1只体细胞核移植动物——“多莉”诞生[1]以来，体细胞核移植技术已经发展十几年的时间，由于其在核质互作、濒危动物保护方面具有深远的应用前景[2]，同时可利用的大量濒危动物卵母细胞通常很难获得，而屠宰场屠宰后的母牛卵巢方便获取且易获得大量卵母细胞作为受体胞质，利用其进行种间体细胞核移植技术研究在当前较广泛。但是包括牛在内的家畜卵母细胞不像鼠科动物的卵母细胞在光学显微镜下可以直接看到细胞核[3]，所以通常去核时采用盲吸法[4]、荧光辅助法[5]或秋水仙胺（demecolcine，DEME）诱导显核法[6]。利用盲吸法去核时为了提高去核效率通常要去除较大体积的胞质，之后还需要在紫外光下照射以确定去核成功率，这会给受体胞质造成不可逆的伤害，而荧光辅助法去核法同样需要对卵母细胞进行紫外光照射，具有同样或更重的伤害[7]。DEME诱导显核法利用DEME对受体卵母细胞处理后能够破坏其微管稳定性、干扰染色体的正常分离和纺锤体的功能促进核内所有染色质聚集在胞质表面形成一个突起，去核时仅去除极少量的胞质即可达到完全去核的目的，去核后在没有DEME的培养液中培养时即可恢复微管的聚集[8]。本试验就牛卵母细胞经过微滴法体外成熟（invitromature，IVM）不同时间后用DEME处理对其显核情况进行研究，旨在确定DEME诱导去核时的适宜浓度和处理时间，以满足体细胞核移植研究需要，为其进一步应用奠定基础。

1材料与方法

1.1药品与试剂

DEME和丙酮酸钠购自西格玛奥德里奇公司，人绒毛促性腺激素（hCG）和孕马血清促性腺激素（PMSG）购自浙江省宁波市三生药业有限公司，其余试剂均购自生命科技公司。

1.2卵巢的获取及卵母细胞的收集

卵巢采集于吉林省长春市某屠宰场，母牛屠宰后立即采取卵巢将其放入含有双抗的25～35℃生理盐水中，8h内带回实验室。将收集的卵巢剪去附着的系膜和输卵管，用灭菌生理盐水清洗3次后，用带有16号针头的10mL注射器抽吸法收集卵泡液，在体视显微镜下选择卵丘完整、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte-complexes，COCs）用含5%FBS的PBS洗净。

1.3卵母细胞体外成熟

将挑选好的COCs用成熟液洗3次，然后移入平衡2h以上的微滴成熟液中，放入38.5℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。卵母细胞成熟培养液组成为90%M199+10%FBS+10μg/mLPMSG+10μg/mLhCG+0.33mmol/L丙酮酸钠，成熟培养19～22h后置于含3mg/mL透明质酸酶的DPBS中，涡旋混合器振荡去掉卵母细胞周围的卵丘细胞，检查成熟情况，以体视显微镜下观察到卵丘细胞扩展（图1）及排出第一极体（图2）视为成熟。

1.4试验设计

试验一：IVM培养21h后，挑选成熟的卵母细胞随机分组，洗净后放入含0.4μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培养液中，在38.5℃、饱和湿度CO2培养箱中培养30、60、90、120min，在体视显微镜下观察显核情况（图3）。

试验二：IVM培养21h后，挑选成熟的卵母细胞随机分组，洗净后放入含0.3、0.4、0.5、0.6μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培养液中，在38.5℃、饱和湿度CO2培养箱中培养60min，在体视显微镜下观察显核情况（图3）。

试验三：IVM培养19～22h后，挑选成熟的卵母细胞洗净后放入含0.5μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培养液中，在38.5℃、饱和湿度CO2培养箱中培养60min，在体视显微镜下观察显核情况（图3）。

1.5统计分析

结果以“平均值±标准差”表示，数据经SPSS21.0软件进行方差分析和多重比较，差异显著标准为α=0.05。

2结果与分析

2.1DEME处理时间对牛卵母细胞显核效果的影响

牛卵母细胞经0.4μg/mLDEME处理不同时间之后，显核结果如表1所示，60、90、120min组间显核率差异不显著（P>0.05），但是60、120min组的显核率显著高于30min组（P<0.05）。

2.2DEME浓度对牛卵母细胞显核效果的影响

牛卵母细胞经不同浓度DEME处理60min之后，显核结果如表2所示，当DEME的浓度为0.5μg/mL时，显核率最高，为78.9%，显著高于0.3、0.4μg/mL组（P<0.05），但是与0.6μg/mL组差异不显著（P>0.05）。endprint

2.3IVM时间对DEME诱导牛卵母细胞显核效果的影响

牛COCs经IVM不同时间之后，DEME诱导显核结果如表3所示，其中19h组显核率最低，且显著低于21、22h组（P<0.05），但是与20h组差异不显著（P>0.05）；22h组显核率最高，与20、21h组差异不显著（P>0.05）。

3结论与讨论

体细胞核移植技术的一个关键步骤就是受体卵母细胞的去核，去核的成功率直接影响核移植的整体效率，传统的盲吸法对操作者的技术熟练水平要求较高，并且去除胞质较多，不利于核移植胚胎后期的发育。利用DEME进行化学诱导去核不仅去除胞质量较少，而且化学诱导剂作用时间较短，所以对核移植胚胎的后期发育并无明显不良影响，近年来成为采用较多的一种主流方法。应用DEME诱导去核通常采用2种方式：一种是将激活处理后的卵母细胞在一定浓度的DEME中处理相应的时间，使同源染色体随着第二极体排出胞质，这种方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究报道；另一种是将减数第二次分裂中期卵母细胞经过DEME处理后，染色质在卵母细胞胞质表面形成一个包状的突起，在显微镜下利用显微操作去掉突起，同样可以达到去核的目的，主要应用在猪[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME诱导去核的方法在不同动物和不同试验体系下所采用的浓度及作用时间各不相同，Russell等报道，在牛上用DEME诱导去核时采用0.6μg/mL浓度处理90min较好[7]；Meng等采用0.4μg/mL浓度处理30～40min较好[3]，而本研究发现浓度为0.5μg/mL时显核率最高，且显著高于0.4μg/mL组（P<0.05），这与王强等在小鼠上的研究结果[13]一致。本研究发现，随着处理时间延长，有些在前段时间没有胞质突起的在后来会出现胞质突起，所以笔者认为化学诱导去核作为一种辅助的手段在实际应用过程中应根据各自的试验条件探索适宜体系，一般进行体细胞核移植研究时都会根据受体卵母细胞数量而进行多批次的去核操作，这样就可以分别在30、60、90min等时间点（或根据试验进度）多次挑选具有胞质突起的卵母细胞进行去核操作。

由于卵母细胞的细胞核位置会随着IVM时间的延长而远离第一极体[14]，所以笔者研究了IVM时间对DEME诱导牛卵母细胞显核效果的影响，结果显示22h组显核率最高，但是与20、21h组差异不显著（P>0.05），说明在牛卵母细胞IVM20～22h这段时间里进行DEME处理效果较适宜，同时在试验过程中发现随着时间的延长，DEME诱导的胞质突起距离第一极体较远的概率增高，这与李裕强等的报道[14-15]一致。

参考文献：

[1]WilmutI，SchniekeAE，McwhirJ，etal.Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells[J].Nature，1997，385（6619）：810-813.[HJ1.82mm]

[2]KaedeiY，FujiwaraA，TaniharaF，etal.Invitrodevelopmentofcatinterspeciesnucleartransferusingpigsandcowscytoplasm[J].BulletinoftheVeterinaryInstituteinPulawy，2010，54（3）：405-408.

[3]MengQG，WuX，BunchTD，etal.Enucleationofdemecolcine-treatedbovineoocytesincytochalasin-freemedium：mechanisminvestigationandpracticalimprovement[J].CellularReprogramming，2011，13（5）：411-418.

[4]LorthongpanichC，LaowtammathronC，ChanAW，etal.Developmentofinterspeciesclonedmonkeyembryosreconstructedwithbovineenucleatedoocytes[J].TheJournalofReproductionandDevelopment，2008，54（5）：306-313.

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[6]YinXJ，TaniT，YonemuraI，etal.Productionofclonedpigsfromadultsomaticcellsbychemicallyassistedremovalofmaternalchromosomes[J].BiologyofReproduction，2002，67（2）：442-446.

[7]RussellDF，IbáezE，AlbertiniDF，etal.Activatedbovinecytoplastspreparedbydemecolcine-inducedenucleationsupportdevelopmentofnucleartransferembryosinvitro[J].MolecularReproductionandDevelopment，2005，72（2）：161-170.

[8]Costa-BorgesN，ParamioMT，CalderónG，etal.Antimitotictreatmentsforchemicallyassistedoocyteenucleationinnucleartransferprocedures[J].CloningandStemCells，2009，11（1）：153-166.

[9]Costa-BorgesN，ParamioMT，SantalóJ，etal.Demecolcine-andnocodazole-inducedenucleationinmouseandgoatoocytesforthepreparationofrecipientcytoplastsinsomaticcellnucleartransferprocedures[J].Theriogenology，2011，75（3）：527-541.

[10]YinXJ，KatoY，TsunodaY.Effectofenucleationproceduresandmaturationconditionsonthedevelopmentofnuclear-transferredrabbitoocytesreceivingmalefibroblastcells[J].Reproduction，2002，124（1）：41-47.

[11]王玉涵，朱玉霞，尹多，等.化学辅助去核法对延边黄牛卵母细胞去核率及其重构胚发育率的影响[J].江西农业大学学报，2011，33（2）：340-344.

[12]SongK，HyunSH，ShinT，etal.Post-activationtreatmentwithdemecolcineimprovesdevelopmentofsomaticcellnucleartransferembryosinpigsbymodifyingtheremodelingofdonornuclei[J].MolecularReproductionandDevelopment，2009，76（7）：611-619.

[13]王强，安志兴，顾玲，等.脱羰秋水仙碱诱导昆明白小鼠卵母细胞去核的研究[J].遗传，2004，26（5）：653-657.

[14]李裕强，张琇，安志兴，等.牛卵母细胞的去核与激活[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2004，32（11）：6-10.

[15]严兴荣，雷安民，沈文正，等.小鼠不同卵龄卵母胞细纺锤体位置及对去核效率的影响[J].中国农学通报，2005，21（5）：9-12.endprint

2.3IVM时间对DEME诱导牛卵母细胞显核效果的影响

牛COCs经IVM不同时间之后，DEME诱导显核结果如表3所示，其中19h组显核率最低，且显著低于21、22h组（P<0.05），但是与20h组差异不显著（P>0.05）；22h组显核率最高，与20、21h组差异不显著（P>0.05）。

3结论与讨论

体细胞核移植技术的一个关键步骤就是受体卵母细胞的去核，去核的成功率直接影响核移植的整体效率，传统的盲吸法对操作者的技术熟练水平要求较高，并且去除胞质较多，不利于核移植胚胎后期的发育。利用DEME进行化学诱导去核不仅去除胞质量较少，而且化学诱导剂作用时间较短，所以对核移植胚胎的后期发育并无明显不良影响，近年来成为采用较多的一种主流方法。应用DEME诱导去核通常采用2种方式：一种是将激活处理后的卵母细胞在一定浓度的DEME中处理相应的时间，使同源染色体随着第二极体排出胞质，这种方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究报道；另一种是将减数第二次分裂中期卵母细胞经过DEME处理后，染色质在卵母细胞胞质表面形成一个包状的突起，在显微镜下利用显微操作去掉突起，同样可以达到去核的目的，主要应用在猪[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME诱导去核的方法在不同动物和不同试验体系下所采用的浓度及作用时间各不相同，Russell等报道，在牛上用DEME诱导去核时采用0.6μg/mL浓度处理90min较好[7]；Meng等采用0.4μg/mL浓度处理30～40min较好[3]，而本研究发现浓度为0.5μg/mL时显核率最高，且显著高于0.4μg/mL组（P<0.05），这与王强等在小鼠上的研究结果[13]一致。本研究发现，随着处理时间延长，有些在前段时间没有胞质突起的在后来会出现胞质突起，所以笔者认为化学诱导去核作为一种辅助的手段在实际应用过程中应根据各自的试验条件探索适宜体系，一般进行体细胞核移植研究时都会根据受体卵母细胞数量而进行多批次的去核操作，这样就可以分别在30、60、90min等时间点（或根据试验进度）多次挑选具有胞质突起的卵母细胞进行去核操作。

由于卵母细胞的细胞核位置会随着IVM时间的延长而远离第一极体[14]，所以笔者研究了IVM时间对DEME诱导牛卵母细胞显核效果的影响，结果显示22h组显核率最高，但是与20、21h组差异不显著（P>0.05），说明在牛卵母细胞IVM20～22h这段时间里进行DEME处理效果较适宜，同时在试验过程中发现随着时间的延长，DEME诱导的胞质突起距离第一极体较远的概率增高，这与李裕强等的报道[14-15]一致。

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[8]Costa-BorgesN，ParamioMT，CalderónG，etal.Antimitotictreatmentsforchemicallyassistedoocyteenucleationinnucleartransferprocedures[J].CloningandStemCells，2009，11（1）：153-166.

[9]Costa-BorgesN，ParamioMT，SantalóJ，etal.Demecolcine-andnocodazole-inducedenucleationinmouseandgoatoocytesforthepreparationofrecipientcytoplastsinsomaticcellnucleartransferprocedures[J].Theriogenology，2011，75（3）：527-541.

[10]YinXJ，KatoY，TsunodaY.Effectofenucleationproceduresandmaturationconditionsonthedevelopmentofnuclear-transferredrabbitoocytesreceivingmalefibroblastcells[J].Reproduction，2002，124（1）：41-47.

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[12]SongK，HyunSH，ShinT，etal.Post-activationtreatmentwithdemecolcineimprovesdevelopmentofsomaticcellnucleartransferembryosinpigsbymodifyingtheremodelingofdonornuclei[J].MolecularReproductionandDevelopment，2009，76（7）：611-619.

[13]王强，安志兴，顾玲，等.脱羰秋水仙碱诱导昆明白小鼠卵母细胞去核的研究[J].遗传，2004，26（5）：653-657.

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2.3IVM时间对DEME诱导牛卵母细胞显核效果的影响

牛COCs经IVM不同时间之后，DEME诱导显核结果如表3所示，其中19h组显核率最低，且显著低于21、22h组（P<0.05），但是与20h组差异不显著（P>0.05）；22h组显核率最高，与20、21h组差异不显著（P>0.05）。

3结论与讨论

体细胞核移植技术的一个关键步骤就是受体卵母细胞的去核，去核的成功率直接影响核移植的整体效率，传统的盲吸法对操作者的技术熟练水平要求较高，并且去除胞质较多，不利于核移植胚胎后期的发育。利用DEME进行化学诱导去核不仅去除胞质量较少，而且化学诱导剂作用时间较短，所以对核移植胚胎的后期发育并无明显不良影响，近年来成为采用较多的一种主流方法。应用DEME诱导去核通常采用2种方式：一种是将激活处理后的卵母细胞在一定浓度的DEME中处理相应的时间，使同源染色体随着第二极体排出胞质，这种方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究报道；另一种是将减数第二次分裂中期卵母细胞经过DEME处理后，染色质在卵母细胞胞质表面形成一个包状的突起，在显微镜下利用显微操作去掉突起，同样可以达到去核的目的，主要应用在猪[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME诱导去核的方法在不同动物和不同试验体系下所采用的浓度及作用时间各不相同，Russell等报道，在牛上用DEME诱导去核时采用0.6μg/mL浓度处理90min较好[7]；Meng等采用0.4μg/mL浓度处理30～40min较好[3]，而本研究发现浓度为0.5μg/mL时显核率最高，且显著高于0.4μg/mL组（P<0.05），这与王强等在小鼠上的研究结果[13]一致。本研究发现，随着处理时间延长，有些在前段时间没有胞质突起的在后来会出现胞质突起，所以笔者认为化学诱导去核作为一种辅助的手段在实际应用过程中应根据各自的试验条件探索适宜体系，一般进行体细胞核移植研究时都会根据受体卵母细胞数量而进行多批次的去核操作，这样就可以分别在30、60、90min等时间点（或根据试验进度）多次挑选具有胞质突起的卵母细胞进行去核操作。

由于卵母细胞的细胞核位置会随着IVM时间的延长而远离第一极体[14]，所以笔者研究了IVM时间对DEME诱导牛卵母细胞显核效果的影响，结果显示22h组显核率最高，但是与20、21h组差异不显著（P>0.05），说明在牛卵母细胞IVM20～22h这段时间里进行DEME处理效果较适宜，同时在试验过程中发现随着时间的延长，DEME诱导的胞质突起距离第一极体较远的概率增高，这与李裕强等的报道[14-15]一致。

参考文献：

[1]WilmutI，SchniekeAE，McwhirJ，etal.Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells[J].Nature，1997，385（6619）：810-813.[HJ1.82mm]

[2]KaedeiY，FujiwaraA，TaniharaF，etal.Invitrodevelopmentofcatinterspeciesnucleartransferusingpigsandcowscytoplasm[J].BulletinoftheVeterinaryInstituteinPulawy，2010，54（3）：405-408.

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[7]RussellDF，IbáezE，AlbertiniDF，etal.Activatedbovinecytoplastspreparedbydemecolcine-inducedenucleationsupportdevelopmentofnucleartransferembryosinvitro[J].MolecularReproductionandDevelopment，2005，72（2）：161-170.

[8]Costa-BorgesN，ParamioMT，CalderónG，etal.Antimitotictreatmentsforchemicallyassistedoocyteenucleationinnucleartransferprocedures[J].CloningandStemCells，2009，11（1）：153-166.

[9]Costa-BorgesN，ParamioMT，SantalóJ，etal.Demecolcine-andnocodazole-inducedenucleationinmouseandgoatoocytesforthepreparationofrecipientcytoplastsinsomaticcellnucleartransferprocedures[J].Theriogenology，2011，75（3）：527-541.

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[11]王玉涵，朱玉霞，尹多，等.化学辅助去核法对延边黄牛卵母细胞去核率及其重构胚发育率的影响[J].江西农业大学学报，2011，33（2）：340-344.

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[13]王强，安志兴，顾玲，等.脱羰秋水仙碱诱导昆明白小鼠卵母细胞去核的研究[J].遗传，2004，26（5）：653-657.

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[15]严兴荣，雷安民，沈文正，等.小鼠不同卵龄卵母胞细纺锤体位置及对去核效率的影响[J].中国农学通报，2005，21（5）：9-12.endprint