徐艳+江建敏+国骏+纪明山

摘要：通过液体发酵培养获得黄瓜褐斑病菌菌丝，再经反复冻融法获得菌丝蛋白，研究不同浓度菌丝蛋白对小麦种子萌发及生长的影响。结果表明，黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白能显著促进小麦种子萌发及幼苗生长，具有激活蛋白的功能。不同浓度菌丝蛋白对小麦种子萌发及幼苗生长的促进作用不同，其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦种子萌发及生长的促进作用最明显：种子萌发率从70%提高到85%；处理5、7、9、11d幼苗株高与对照组相比分别提高25%、50%、58%、45%。小麦抗旱性诱导作用也以0.625mg/mL菌丝蛋白处理的小麦最佳，与对照相比，幼苗存活率提高21.28百分点，抗衰度提高19.58百分点，苗抗旱综合系数从35.45提高到55.88，是对照的1.57倍，根系活力是对照的2倍。

关键词：黄瓜褐斑病；菌丝蛋白；激活蛋白；种子萌发；生长；抗旱性；小麦

中图分类号：S512.101文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0159-02

激活蛋白是一类从真菌中分离的、具有激发子功能的新型蛋白质。激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统，提高植物自身免疫力，激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根、茎、叶生长和叶绿素含量提高，从而达到提高作物产量的目的[1]。基因芯片分析结果表明，激活蛋白处理后，水稻一系列与防御和生长相关的基因上调表达[2]。激活蛋白能诱导多种植物产生系统抗性，促进植物生长，改善作物品质。激活蛋白在交链孢菌（Alternariasp.）、纹枯病菌（Rhizoctoniasolani）、黄曲霉菌（Aspergillussp.）、稻瘟菌（Magnaportegrisea）、青霉菌（Penicilliumsp.）、木霉菌（Trichodermasp.）、镰刀菌（Fusariumsp.）等多种真菌中都有发现[3]，不同来源的蛋白激发子在理化性质上略有差异，但生物活性相似。为进一步发掘具有我国自主知识产权的新型激活蛋白，本研究以黄瓜褐斑病菌为试验材料，通过液体发酵获得菌丝，低温提取其蛋白，研究其生物功能。

1材料与方法

1.1主要材料和仪器

黄瓜褐斑病菌由沈阳农业大学植物保护学院生物农药实验室提供。

离心机，恒温水浴锅，电子天平，旋转蒸发仪，真空干燥箱，培养皿（直径90mm），自动恒温箱。

1.2方法

1.2.1黄瓜褐斑病菌菌丝体的培养

用接种针挑取少许黄瓜褐斑病菌菌丝，接种到PDA固体培养基上，放置在培养箱中28℃恒温培养7d后，取直径1cm的固体培养菌块接种到200mLYPD液体培养基中，于28℃恒温振荡培养4～5d，真空抽滤收集菌丝体，用双蒸水反复洗涤4次，低温干燥。

1.2.2黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白的获得

取黄瓜褐斑病菌菌丝体10g，用粉碎机粉碎，置于烧杯中于-25℃反复冻融2次，在高速冷冻离心机上12000r/min离心15min，收集上清，冷冻干燥，冻存于-20℃冰箱中备用。

1.2.3黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白含量的测定

蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。

蛋白质标准曲线：取牛血清白蛋白，配制成浓度1mg/mL，用蒸馏水分别稀释成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL。准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入具塞试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，放置2min后，在595nm处测定吸光度。

菌丝蛋白含量测定：称取菌丝蛋白，用蒸馏水配制成浓度梯度。分别量取上述溶液0.1mL并放入20mL具塞试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，将试管中溶液缓慢混合均匀，放置2min后，在595nm处测定吸光度。

1.2.4黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦种子萌发及幼苗生长的影响[4-5]

取籽粒饱满的小麦种子，消毒后用不同浓度菌丝蛋白浸种8h，每处理20粒种子，置于铺有滤纸的培养皿中，以蒸馏水为对照，12h后记录发芽率，于培养5、7、9、11d时测量株高。

1.2.5黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦抗旱性诱导作用的影响[6]

取健康饱满的小麦种子，消毒后用不同浓度菌丝蛋白浸种8h，每处理20粒种子置于铺有滤纸的培养皿中，然后加入60g石英砂，以蒸馏水为对照，适时补水。小麦生长14d时停止补水，进行干旱胁迫，当70%植株萎蔫、叶片卷成针状时复水，再次干旱胁迫后，再复水，1d后统计幼苗存活率和叶片抗衰度，计算幼苗抗旱综合系数。各处理均重复3次。

幼苗存活率=（第1次干旱胁迫后存活株数/第1次干旱胁迫前株数+第2次干旱胁迫后存活株数/第1次干旱胁迫后存活株数）×0.5×100%；

叶片抗衰度=（叶片绿色段长/叶片全长）×100%；

幼苗抗旱综合系数=（幼苗存活率+叶片抗衰度）×100/2。

1.2.6黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦植株根系活力的影响[7]

采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定根系活力。称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4%TTC溶液和66mmol/LpH值7.0的磷酸缓冲液的等量混合液10mL，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol/L硫酸2mL，停止反应。与此同时做一空白试验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上。然后把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯或丙酮3～4mL和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提取三苯基甲腙。将红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯或丙酮把残渣洗涤3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯或丙酮使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线即可求出TTC的还原量。

TTC还原强度=TTC还原量（g）/[根重（g）×时间（h）]。

标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2mL放入10mL量瓶中，加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色的三苯基甲腙，再用乙酸乙酯或丙酮定容至刻度，摇匀。然后分别取该液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mL置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得含三苯基甲腙25、50、100、150、200μg/mL的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度。

2结果与分析

2.1黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦种子萌发的影响

由图1可以看出，与对照相比，黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白能显著促进小麦种子萌发。不同浓度菌丝蛋白浸泡过的小麦种子萌发率均高于对照，其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦生长的促进作用最明显，种子萌发率从70%提高到85%。

2.2黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦生长的影响

由图2可知，经菌丝蛋白液处理后，小麦的生长速率也明

显提高，幼苗生长旺盛，株高明显高于对照，其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦种子生长的促进作用最显著，处理5、7、9、11d幼苗株高与对照相比分别提高25%、5%、58%、45%。

2.3黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦诱导抗旱性及根系活力的影响

对小麦进行干旱胁迫后，对照组的小麦大部分萎蔫，而菌丝蛋白组处理的小麦生长良好，保持直立状态。其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦抗旱性作用最显著，干旱复水后，0.625mg/mL菌丝蛋白处理的小麦幼苗存活率比对照提高21.28百分点，抗衰度比对照提高19.58百分点，幼苗抗旱综合系数从35.45提高到55.88，是对照的1.57倍，根系活力是对照的2倍（表1），说明黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白增强了小麦的抗旱性。

3结论与讨论

本试验结果表明，黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦种子萌发及生长表现为促进作用，具有激活蛋白的功能。经过0.625mg/mL菌丝蛋白处理过的小麦种子生长最好，并且能够增强小麦的抗旱性。

本试验仅研究了单一的作物小麦，而激活蛋白的应用范围很广，因此它对其他作物（如黄瓜、番茄等）的影响可作进一步研究。

本试验研究了激活蛋白对小麦种子萌发及幼苗生长的影响，仅仅验证了其促进萌发、促进幼苗生长及抗旱功效，而激活蛋白的功能还很多，可作进一步研究。本研究所用黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白仅为粗蛋白，有必要继续对其进行分离纯化获得活性物质并进行进一步研究。

参考文献：

[1]邱德文.植物用多功能真菌蛋白质：中国，0112866.0[P].2002-04-17.

[2]赵利辉，邱德文，刘峥，等.植物激活蛋白对水稻抗性相关基因转录水平的影响[J].中国农业科学，2005，38（7）：1358-1363.

[3]黄丽俊，邱德文，刘峥，等.应用表达谱基因芯片筛选植物激活蛋白处理水稻相关差异基因[J].科学技术与工程，2005，5（24）：1885-1889.

[4]张志刚，[HJ2.1mm]邱德文，杨秀芬，等.新型激活蛋白对棉花种子发芽及幼苗生长的影响[J].江西农业学报，2006，18（3）：1-5.

[5]徐锋，杨勇，谢馥交，等.稻瘟菌激活蛋白对植物生长及其生理活性的影响[J].华北农学报，2006，21（5）：1-5.

[6]张云华.灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化、基因克隆与功能研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2008.

[7]张志良，瞿伟.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2003：277-278.

标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2mL放入10mL量瓶中，加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色的三苯基甲腙，再用乙酸乙酯或丙酮定容至刻度，摇匀。然后分别取该液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mL置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得含三苯基甲腙25、50、100、150、200μg/mL的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度。

2结果与分析

2.1黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦种子萌发的影响

由图1可以看出，与对照相比，黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白能显著促进小麦种子萌发。不同浓度菌丝蛋白浸泡过的小麦种子萌发率均高于对照，其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦生长的促进作用最明显，种子萌发率从70%提高到85%。

2.2黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦生长的影响

由图2可知，经菌丝蛋白液处理后，小麦的生长速率也明

显提高，幼苗生长旺盛，株高明显高于对照，其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦种子生长的促进作用最显著，处理5、7、9、11d幼苗株高与对照相比分别提高25%、5%、58%、45%。

2.3黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦诱导抗旱性及根系活力的影响

对小麦进行干旱胁迫后，对照组的小麦大部分萎蔫，而菌丝蛋白组处理的小麦生长良好，保持直立状态。其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦抗旱性作用最显著，干旱复水后，0.625mg/mL菌丝蛋白处理的小麦幼苗存活率比对照提高21.28百分点，抗衰度比对照提高19.58百分点，幼苗抗旱综合系数从35.45提高到55.88，是对照的1.57倍，根系活力是对照的2倍（表1），说明黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白增强了小麦的抗旱性。

3结论与讨论

本试验结果表明，黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦种子萌发及生长表现为促进作用，具有激活蛋白的功能。经过0.625mg/mL菌丝蛋白处理过的小麦种子生长最好，并且能够增强小麦的抗旱性。

本试验仅研究了单一的作物小麦，而激活蛋白的应用范围很广，因此它对其他作物（如黄瓜、番茄等）的影响可作进一步研究。

本试验研究了激活蛋白对小麦种子萌发及幼苗生长的影响，仅仅验证了其促进萌发、促进幼苗生长及抗旱功效，而激活蛋白的功能还很多，可作进一步研究。本研究所用黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白仅为粗蛋白，有必要继续对其进行分离纯化获得活性物质并进行进一步研究。

参考文献：

[1]邱德文.植物用多功能真菌蛋白质：中国，0112866.0[P].2002-04-17.

[2]赵利辉，邱德文，刘峥，等.植物激活蛋白对水稻抗性相关基因转录水平的影响[J].中国农业科学，2005，38（7）：1358-1363.

[3]黄丽俊，邱德文，刘峥，等.应用表达谱基因芯片筛选植物激活蛋白处理水稻相关差异基因[J].科学技术与工程，2005，5（24）：1885-1889.

[4]张志刚，[HJ2.1mm]邱德文，杨秀芬，等.新型激活蛋白对棉花种子发芽及幼苗生长的影响[J].江西农业学报，2006，18（3）：1-5.

[5]徐锋，杨勇，谢馥交，等.稻瘟菌激活蛋白对植物生长及其生理活性的影响[J].华北农学报，2006，21（5）：1-5.

[6]张云华.灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化、基因克隆与功能研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2008.

[7]张志良，瞿伟.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2003：277-278.

标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2mL放入10mL量瓶中，加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色的三苯基甲腙，再用乙酸乙酯或丙酮定容至刻度，摇匀。然后分别取该液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mL置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得含三苯基甲腙25、50、100、150、200μg/mL的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度。

2结果与分析

2.1黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦种子萌发的影响

由图1可以看出，与对照相比，黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白能显著促进小麦种子萌发。不同浓度菌丝蛋白浸泡过的小麦种子萌发率均高于对照，其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦生长的促进作用最明显，种子萌发率从70%提高到85%。

2.2黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦生长的影响

由图2可知，经菌丝蛋白液处理后，小麦的生长速率也明

显提高，幼苗生长旺盛，株高明显高于对照，其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦种子生长的促进作用最显著，处理5、7、9、11d幼苗株高与对照相比分别提高25%、5%、58%、45%。

2.3黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦诱导抗旱性及根系活力的影响

对小麦进行干旱胁迫后，对照组的小麦大部分萎蔫，而菌丝蛋白组处理的小麦生长良好，保持直立状态。其中以0.625mg/mL菌丝蛋白对小麦抗旱性作用最显著，干旱复水后，0.625mg/mL菌丝蛋白处理的小麦幼苗存活率比对照提高21.28百分点，抗衰度比对照提高19.58百分点，幼苗抗旱综合系数从35.45提高到55.88，是对照的1.57倍，根系活力是对照的2倍（表1），说明黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白增强了小麦的抗旱性。

3结论与讨论

本试验结果表明，黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白对小麦种子萌发及生长表现为促进作用，具有激活蛋白的功能。经过0.625mg/mL菌丝蛋白处理过的小麦种子生长最好，并且能够增强小麦的抗旱性。

本试验仅研究了单一的作物小麦，而激活蛋白的应用范围很广，因此它对其他作物（如黄瓜、番茄等）的影响可作进一步研究。

本试验研究了激活蛋白对小麦种子萌发及幼苗生长的影响，仅仅验证了其促进萌发、促进幼苗生长及抗旱功效，而激活蛋白的功能还很多，可作进一步研究。本研究所用黄瓜褐斑病菌菌丝蛋白仅为粗蛋白，有必要继续对其进行分离纯化获得活性物质并进行进一步研究。

参考文献：

[1]邱德文.植物用多功能真菌蛋白质：中国，0112866.0[P].2002-04-17.

[2]赵利辉，邱德文，刘峥，等.植物激活蛋白对水稻抗性相关基因转录水平的影响[J].中国农业科学，2005，38（7）：1358-1363.

[3]黄丽俊，邱德文，刘峥，等.应用表达谱基因芯片筛选植物激活蛋白处理水稻相关差异基因[J].科学技术与工程，2005，5（24）：1885-1889.

[4]张志刚，[HJ2.1mm]邱德文，杨秀芬，等.新型激活蛋白对棉花种子发芽及幼苗生长的影响[J].江西农业学报，2006，18（3）：1-5.

[5]徐锋，杨勇，谢馥交，等.稻瘟菌激活蛋白对植物生长及其生理活性的影响[J].华北农学报，2006，21（5）：1-5.

[6]张云华.灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化、基因克隆与功能研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2008.

[7]张志良，瞿伟.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2003：277-278.