转P5CS基因马铃薯“东农303”耐盐、抗旱性研究

2015-01-15李葵花高玉亮吴京姬

江苏农业科学 2014年11期

李葵花+高玉亮+吴京姬

摘要：利用拟南芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）进行了马铃薯品种“东农303”的遗传转化，在盐和干旱胁迫下研究转基因植株的耐盐性和抗旱性。经PCR扩增，证实P5CS基因已整合到马铃薯基因组中。用150mmol/LNaCl溶液和干旱（基质含水量为20%～25%）胁迫处理20d，发现转基因植株叶片的脯氨酸含量显著增加，SOD活性明显上升，而丙二醛积累量则缓慢，从而说明该品种更适合生长在干旱和盐胁迫条件下。

关键词：马铃薯；P5CS基因；耐盐性；抗旱性；SOD；丙二醛

中图分类号：S532.03文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0131-03

在干旱和盐碱土壤等逆境条件下生长的农作物，因受到渗透胁迫而严重影响其新陈代谢，造成大幅减产。据统计，全球干旱、半干旱地区约占陆地面积的34.9%，在我国，由于干旱引起的主要农作物减产量约为总产量的50%，盐碱地面积则高达9913.3万hm2，且有增加趋势[1-2]。植物体在一定范围的干旱和盐碱胁迫下，大量合成并积累脯氨酸、甜菜碱等有机化合物来调节渗透压，降低水势，完全或部分地维持细胞膨压，从而保证植物体内生理生化过程的顺利进行[3-4]。在渗透胁迫下脯氨酸主要来源于谷氨酸合成途径，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase，P5CS）是脯氨酸合成的关键酶，催化谷氨酸磷酸化并还原谷氨酸-γ-半醛，同时P5CS活性又受到脯氨酸的反馈调节。P5CS基因可被干旱、高盐和脱落酸诱导表达，对高温或低温诱导没有反应[5]。过量表达P5CS基因的烟草植株在干旱和盐胁迫下大量积累脯氨酸来维持其渗透压，在400mmol/L的盐胁迫下，转基因烟草植株根的干物质量增加[6]；转P5CS基因水稻实生1代的组织培养苗在100mmol/LNaCl胁迫下植株高度、鲜质量比对照植株均有明显增加；转豇豆P5CS基因水稻实生1代在田间干旱条件下积累大量脯氨酸，生长势明显优于对照植株，表明水稻实生1代可稳定表达外源P5CS基因，并具有抗干旱、抗盐碱能力[7]。在250mmol/L盐胁迫下，转P5CS基因水稻细胞系的鲜重比野生型高6～8倍，其脯氨酸含量为对照的241%[8]；转拟南芥P5CS基因大豆在干旱胁迫下能够快速积累脯氨酸，提高抗旱性；在正常供水条件下，转P5CS基因柑橘的脯氨酸含量与对照无明显差异，而在水分胁迫下，转基因植株脯氨酸积累量明显高于对照，抗旱性得到了较大增强[9]。上述试验均证明P5CS基因的转入能提高植物的抗逆性。

目前，我国东北地区土壤盐碱化面积日渐扩大，旱涝等非生物胁迫逆境环境也频繁发生，开发适合栽培于逆境土壤的抗旱、抗盐碱等抗逆性作物势在必行。马铃薯是常见的粮菜间作作物，生育期短、适应性强、产量高，具有较好的经济效益。本研究把拟南芥P5CS基因转入马铃薯品种“东农303”中，并在干旱和盐碱胁迫环境下测定了转基因植株体内脯氨酸、丙二醛的含量及SOD活性，为选育抗旱耐盐的马铃薯新品种奠定理论基础。

1材料与方法

1.1遗传转化受体材料及菌株

将消毒的“东农303”马铃薯微型薯切成10.0mm×10.0mm×1.5mm大小的薄片作为农杆菌转化的受体材料；菌株为含有pCAM-BIA-1301-P5CS质粒的LBA4404根癌农杆菌，由笔者所在实验室保存。

1.2农杆菌介导遗传转化

将受体材料浸泡于LBA4404农杆菌悬浮液（吸光度D600nm=0.3）20min，共侵染1000个外植体。侵染外植体置于再分化培养基（MS基本培养基+5.0mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+30g/L蔗糖+500mg/L羧苄青霉素+6mg/L潮霉素）中，在25℃、16h/d光照条件下培养，每15d继代1次。外植体在再分化培养基中约4周开始分化出芽，当再生芽长到20mm高度时，继代到抗性生根培养基上（MS基本培养基+30g/L蔗糖+500mg/L羧苄青霉素+10mg/L潮霉素），统计遗传转化率（遗传转化率=再生抗性植株/侵染外植体总数×100%）。

1.3PCR检测

取抗性植株叶片，用CTAB法提取植物总DNA，以引物P5CS-F（5′-GTTTTTGAATCCCGGCCTGA-3′）和P5CS-R（5′-TCCACTTGGCGGAGGAATAT-3′）检测P5CS基因。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；于72℃延伸7min，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4胁迫处理材料培养

当转基因和非转基因试管苗长至8～10张叶时，将其切成茎段（带1～2张叶）后接入MS+30g/L蔗糖的液体培养基中静置培养，在25℃、光强2000lx、光照时间16h/d条件下培养。培养20d后将生根试管苗从培养基中取出栽植到含等量腐殖土和草炭土的营养钵中，每营养钵栽1株。将这些营养钵置于玻璃温室内，每隔2d浇透水。20d后当植株长至约15cm时，用于胁迫处理。

1.5盐和干旱胁迫处理

分别选取30株在营养钵中生长20d的长势一致的转基因和非转基因植株，每天08：00进行胁迫处理。盐胁迫：每隔2d浇1次150mmol/LNaCl溶液，每次浇灌500mL/钵，处理7次，随机选取培养20d的植株中间同一部位的叶片用于耐盐性鉴定。干旱胁迫：干旱胁迫处理开始前2d停止浇水，使基质处于含水量为20%～25%的干旱条件，并维持干旱条件20d，随机选取胁迫处理植株的中间同一部位叶片进行抗旱性鉴定。盐胁迫和干旱胁迫分别处理5株，3次重复，同时观察植株生长势。

1.6耐盐性和抗旱性鉴定

采用硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛（MDA）含量，茚三酮比色法测定脯氨酸含量，核黄素-NBT法测定SOD活性。

1.7数据统计与分析

试验数据采用SPSS软件进行Duncans多重比较（P<0.05）检验显著性，采用Excel2007软件作图。

2结果与分析

2.1抗性植株的PCR检测

用6mg/L潮霉素筛选农杆菌介导遗传转化的再生抗性芽，共获得3个抗性株系，遗传转化效率为0.3%。把抗性芽继代至抗性生根培养基（含10mg/L潮霉素）中，其中1个株系生长正常，另2个株系生长较缓慢；对正常生长株系进行大量扩繁。用CTAB法提取叶片总DNA进行PCR检测，扩增产物电泳分析结果表明，转基因植株与阳性质粒均扩增出701bp相同大小的特异条带（图1），而非转基因植株则无此特异条带，证明P5CS基因已整合到再生抗性马铃薯植株中。

2.2耐盐性和抗旱性

2.2.1游离脯氨酸含量

植物在高盐、干旱等逆境下会大量积累游离脯氨酸来降低渗透胁迫所造成的氧伤害，保护胁迫下的植物体，因此，在相同胁迫条件下，同品种马铃薯植株中脯氨酸积累量越多，表明其抗逆性越强。图2表示转基因和非转基因植株在150mmol/LNaCl胁迫和基质含水量为20%～25%的干旱胁迫下叶片中游离脯氨酸的含量。从图2可知，转基因和非转基因植株在盐和干旱胁迫下均有脯氨酸积累，尤其是在盐胁迫下积累了大量脯氨酸；盐和干旱胁迫下转基因植株的脯氨酸含量分别为非转基因植株的1.7倍和1.3倍，明显高于非转基因植株。表明转P5CS基因植株在盐和干旱胁迫下可大量合成脯氨酸，从而更能适应逆境环境。

2.2.2丙二醛（MDA）含量

植物在逆境或衰老过程中遭受伤害时，因膜脂过氧化而导致生物膜的破坏，最终分解为MDA。MDA含量的高低与细胞膜的伤害程度呈正相关，即MDA含量可反映植物遭受逆境伤害的程度，含量越高表明对膜和细胞造成的伤害越大[10]。由图3可知，在盐和干旱胁迫下转基因和非转基因植株均产生MDA，但转基因植株叶片MDA的产生量明显低于非转基因植株。在150mmol/LNaCl胁迫和20%～25%的基质含水量条件下，转基因植株叶片中的MDA含量只有非转基因植株的50.3%和65.8%，表明在盐和干旱胁迫下转基因植株积累的MDA含量较少，使细胞膜伤害程度明显降低而达到植株能够较正常生长。

2.2.3超氧化物歧化酶（SOD）活性

SOD是清除植物体内活性氧自由基的最重要的保护酶之一，在植物器官衰老或在逆境胁迫下，SOD能够使细胞免受伤害从而起到保护作用，其活性越高清除活性氧的能力就越强。由图4可以看出，转基因和非转基因植株在盐胁迫和干旱胁迫下均具SOD活性，但转基因植株的SOD活性显著高于非转基因植株。在150mmol/LNaCl胁迫和基质含水量为20%～25%的干旱胁迫下，转基因植株的SOD活性是非转基因植株的2.67倍和2.87倍。表明转P5CS基因植株在盐和干旱胁迫条件下能够增强SOD活性，进而减轻植株受胁迫的程度。

2.2.4盐和干旱胁迫下植株生长势的初步观察

用150mmol/LNaCl和含水量为20%～25%的基质对转基因和非转基因植株胁迫处理20d后的植株形态学观察表明，转基因植株的耐盐和抗干旱能力显著提高。从图5可以看出，在干旱胁迫下，转基因植株的下部叶片生长较正常，上部叶除叶尖发黄外其他叶片的长势良好；而非转基因植株中、下部叶片已干枯、死亡，上部叶片也明显卷曲、干枯，叶片趋于死亡。在

盐胁迫下，转基因植株生长较良好，只有部分叶呈现少量的白色斑点或叶尖发黄、叶片发生微微卷曲、植株节间缩短的现象；而非转基因植株叶片则全部萎蔫、卷曲严重，甚至干枯死亡。表明转P5CS基因的“东农303”马铃薯植株在盐和干旱胁迫下生长势明显优于非转基因植株。

3结论与讨论

与非转基因植株相比，转拟南芥P5CS基因的马铃薯品种“东农303”在盐和干旱胁迫下叶片中脯氨酸含量显著增加，SOD活性明显上升，而丙二醛积累量则缓慢，说明转P5CS基因“东农303”具有一定的耐盐性和抗旱性。盐和干旱等渗透胁迫会打乱植物细胞的水分平衡，造成植物细胞缺水，最直接的表现就是叶片的萎蔫程度。Sherraf等研究表明，在50mmol/LNaCl胁迫下，马铃薯植株生长势是非胁迫下的50%；在150mmol/LNaCl胁迫下，马铃薯植株的生长势会完全受到抑制，根部吸收能力受到阻碍，细胞间隙之间由碱性物质所饱和，最终造成细胞坏疽和细胞死亡[11]，该研究结果与本试验在150mmol/LNaCl胁迫下非转基因植株叶片已干枯死亡的结果相一致。很多研究已证明转入抗旱或耐盐相关基因可提高农作物对渗透胁迫的耐受能力，进而培育出高抗逆性的新品种。脯氨酸作为植物抵抗渗透胁迫的重要渗透物质，其积累是植物对逆境胁迫所采取的一种自我保护性措施，其含量可反映细胞抗逆性和受害程度[12-13]。Hmida-Sayari等将拟南芥的P5CS基因转入马铃薯中，获得了4个转基因株系，在100mmol/LNaCl胁迫下，转基因植株的脯氨酸积累量在180～1100μg/g鲜叶质量，表明在相同的胁迫条件下，转基因株系间脯氨酸的合成量具有较大差异[14]。本研究中的转基因马铃薯植株在150mmol/LNaCl胁迫下脯氨酸积累量约为3000μg/g鲜叶质量，较高，认为转P5CS植株中脯氨酸的积累量可能是受品种、NaCl胁迫浓度、胁迫处理时间、目的基因拷贝数等的影响，具体的原因有待于进一步研究。

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