郭建华，赵健乔，曹 政

(1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 402460;2.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆 402460)



几种芽孢杆菌共培养对产蛋白酶的影响

郭建华1，赵健乔1，曹 政2*

(1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 402460;2.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆 402460)

[目的]为了研究芽孢杆菌的共发酵对蛋白酶产量的影响。[方法]对4株具有产蛋白酶能力的芽孢杆菌，通过菌株两两配伍发酵或三者配伍共发酵培养，分别检测单一菌株发酵产物和不同菌株共发酵产物的蛋白酶活性。[结果]枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌均具有一定的产蛋白酶能力，枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌共发酵培养48 h后蛋白酶活力有显著提高。[结论]菌株之间的科学配伍在共发酵中可以显著提高蛋白酶的活性。

芽孢杆菌；共发酵；蛋白酶

在饲粮的氨基酸不平衡、蛋白质消化不良的情况下，饲粮中50%～70%的氮随粪、尿排出体外，最终形成污染环境的氨、硫化氢等有臭、有害气体。发酵床养猪是结合现代微生物发酵处理技术而提出的一种环保、安全、有效的生态养猪法[1]。猪粪中含有丰富的有机质，其中蛋白质含量较高，因而向发酵床接种产蛋白酶高的菌种，能有效地促进有机物降解，加速猪粪腐熟进程，还有利于消除致臭物质，减轻对环境的污染[2]。所以，筛选产蛋白酶高的发酵床菌种，并且进行合理的科学配伍，选出高产蛋白酶配伍方式具有很大的意义。

芽孢杆菌(Bacillaceae)是能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtiliis)、纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtiliisnatto)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)已被广泛制作成酶制剂，用于改善动物肠道微生物菌群组成，并且产生蛋白质酶以促进饲粮的消化，弥补体内内原蛋白酶的不足[3-4]。目前的酶制剂有的是单一的菌群，有的是各种细菌的复合制剂，但是各种菌群混合发酵时细菌生长情况和酶学特点目前未见报道。

共培养(Co-culture)是指利用两种或两种以上的微生物同时或有先后的加入培养，有效提高资源的利用率，并获得较高产量的发酵方法。共发酵技术被广泛用于污水处理、沼气生产、土壤修复以及传统食物的生产。与单一菌株发酵相比，不同微生物之间的相互作用可以让共发酵获得以外的效果[5]。笔者研究了几种常见的芽孢杆菌不同组合配比培养条件下细菌的生长情况，同时研究不同发酵组合对生产蛋白酶活性的影响，以获得最适细菌生长、产蛋白酶最多的菌群组合及其比例，为研究、开发相关微生物制剂产品提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌种的活化与培养条件将实验室保存的枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌的菌种划斜面37 ℃培养24 h。供试菌株均采自荣昌县某零排放养猪场垫料。培养基[3]组成为：1%葡萄糖、0.55%酵母膏、0.5%蛋白胨、0.2%KH2PO4、1%Na2CO3、0.2%MgSO4·7H2O，调整pH 8.0。

1.2 产蛋白酶菌株的配伍分别选取具有产蛋白酶能力菌株活化12 h作为种子液按4%的接种量，两两共发酵或三者共发酵接入装有20 ml液体培养基的50 ml三角锥瓶中(各菌株等量接种)，置37 ℃ 160 r/min进行摇瓶发酵培养，分别培养至24、48 h时取发酵液，测定蛋白酶活性，与菌株单独发酵的蛋白酶活性进行比较。

1.3 蛋白酶活力测定将培养了24、48 h的各菌株发酵液于4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，取上清液，即为粗酶液。粗酶液蛋白酶活力测定、蛋白酶活力计算方法、酶活力单位的定义均根据文献[6]进行。

1.4 统计分析对所得结果进行方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单一菌株发酵蛋白酶活性将分离、纯化后得到的纯种菌株按4%的接种量接入发酵培养基，进行菌株单独发酵培养，置37 ℃160 r/min摇床振荡培养后，在培养至24、48 h时提取粗酶液，测定酶活力。由表1可知，实验室所保存的4种芽孢杆菌发酵液均有蛋白酶活性，发酵24 h内4种芽孢杆菌的蛋白酶活性无显著性区别，48 h后枯草芽孢杆菌与纳豆芽孢杆菌的蛋白酶活性显著高于地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。

2.2 不同菌株两两共发酵蛋白酶活性将菌株两两混合进行共发酵培养，测定发酵24、48 h的蛋白酶活性。由表2可知，对菌株两两共发酵24 h后，枯草芽孢杆菌与纳豆芽孢杆菌发酵液的蛋白酶活性在0.05水平显著高于其他组合，发酵48 h后它们的蛋白酶活性与其他组相比差异在0.01水平显著。

表1 单一菌株发酵产物酶活检测 U/ml

发酵时间∥h枯草芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌地衣芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌247.56±0.549.21±0.946.35±0.176.25±0.404812.28±0.40*18.56±0.80**7.48±0.267.32±0.14

注：表中数据均为平均值±标准差(n=3)；*P<0.05；**P<0.01。

表2 两两混合发酵产物蛋白酶酶活检测 U/ml

发酵时间h枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌2414.1±0.36*8.96±1.268.42±0.8810.1±0.5710.2±0.336.94±0.424823.3±0.58**12.5±0.4111.4±0.7116.3±0.5115.9±0.688.06±0.63

注：表中数据均为平均值±标准差(n=3)；*P<0.05；**P<0.01。

2.3 3种菌株共发酵蛋白酶活性选取3种纯化后的菌株进行混合发酵培养，置于37 ℃ 160 r/min摇床振荡培养后，在培养至24、48 h时提取粗酶液，测定酶活力。由表3可知，发酵24、48 h的结果差异不显著，枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵液与枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的发酵液在0.05水平显著高于纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌发酵液的蛋白酶活性。

表3 3种芽孢杆菌共发酵酶活检测 U/ml

发酵时间h枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌2413.57±0.7013.32±0.698.86±0.224815.40±0.48*14.98±0.60*10.12±0.87

注：表中数据均为平均值±标准差(n=3)；*P<0.05。

3 结论与讨论

芽孢杆菌被广泛用于零排放养殖场垫料中，也被广泛用于微生态制剂，作为改善肠道微生物的益生菌。所以，研究芽孢杆菌各种生理生化特性对更好地应用益生菌具有重要的理论与实践意义。该研究对生产实践中最常见的几种芽孢杆菌进行各种组合共发酵[7-8]，旨在揭示产蛋白酶效率最高的组合，为生产实践提供理论指导。

研究中，在发酵培养24、48 h后，单一菌株发酵液中纳豆芽孢杆菌蛋白酶活性最大，枯草芽孢杆菌次之，地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌最小。在两两发酵试验中，共发酵24 h后蛋白酶产量均比单一发酵有所提高，其中枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌混合后产量增加显著，其他五组虽有所增加但增加效果不显著。在两两发酵48 h后，蛋白酶产量比24 h后有所增加，特别是枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌共发酵产蛋白酶量显著高于其他组合。三种芽孢杆菌共发酵产蛋白酶量普遍远远低于两两混合发酵产蛋白酶量。由此可知，在产蛋白酶角度上，三种芽孢杆菌共发酵不适宜被应用到实践生产中去。

[1] 尹红梅，张国民.生态养猪发酵床菌种产蛋白酶特性的研究[J].湖南农业科学，2010(3):116-118.

[2] 谢金防，熊文华，刘林秀，等.对发酵床养猪技术的认识与思考[J].猪业科学，2008(9)：46-47.

[3] CHEN Y L.Development and application of co-culture for ethanol production by co-fermentation of glucose and xylose:a systematic review[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2011,38:581-597.

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[5] PANT G,PRAKASH A,PAVANI J V P，et al.Production,optimization and partial purification of protease fromBacillussubtilis[J].J Taibah Univ Sci，2015,9(1):50-55.

[6] 孙晓鸣，王萍，陈静.纳豆芽孢杆菌配伍发酵产中性蛋白酶的性质研究[J].江西农业大学学报，2010,32(1):163-168.

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Influence of SeveralBacillusCo-fermentation on Protease Activity

GUO Jian-hua1, ZHAO Jian-qiao1, CAO Zheng2*

(1. Department of Veterinary Medicine, Southwest University, Rongchang, Chongqing 402460; 2. Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Rongchang, Chongqing 402460)

[Objective] The research aimed to study the influence of severalBacillusco-fermentation on protease yield. [Method] FourBacillussp. who were capable to produce protease were adopted. Through pairwise compatibility fermenting or three strains of fermentation cultivation compatibility，the protease activities were determined together with single strains of fermented products. [Result]Bacillussubtilin,Bacillusnatty,BacilluslicheniformisandBacilluscereushaveall possessed production protease ability. The highest protease activity was achieved when fermentation withBacillussubtilinandBacillusnattyafter 48 h. [Conclusion]Appropriate co-fermentation could significantly improve the protease production activity.

Bacillus；Co-fermentation；Protease

西南大学科研基金资助(08BSr04)。

郭建华(1977-)，男，江西于都人，副教授，博士，从事微生物资源开发与分子生物学研究工作。*通讯作者，研究员，博士，从事微生物分子生物学研究。

2015-02-09

S 154

A

0517-6611(2015)09-011-02