武 倩 ，魏 蕾，司马学琴，张 涛，甘亚平，蒋汝刚，刘复兴，宁志丰＊＊

(1.武汉大学基础医学院，湖北 武汉 430071;2.湖北科技学院护理学院;3.湖北科技学院基础医学院)

放疗是晚期转移性膀胱癌的主要治疗手段之一，然而放疗的不敏感和癌干细胞对放疗的内在抵抗性常常导致治疗失败。在本研究中，我们评价了沉默ABCG2 是否能够增强膀胱癌T24 对X线的敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料 膀胱癌细胞株T24 购自武汉大学中国典型培养物典藏中心。RPMI 1640 培养基和胎牛血清(FBS)、双抗购买自Hyclone 公司。MTT 购买自Gibco 公司，Transwell 板购买自Coming 公司，Matri 胶为Sigma 公司产品，siRNA 由上海吉玛制药技术有限公司合成。Lipofectamine 2000 购买自Invitrogen 公司。抗人ABCG2 一抗购自Abcam 公司，二抗购自武汉博士德公司。其他试剂为分析纯。

1.2 细胞培养 使用RPMI 1640 培养基添加10% 胎牛血清、100 U 青霉素和100 μg/ml 链霉素的方法将膀胱癌T24 培养在37℃、恒温恒湿的CO2培养箱中，待细胞密度长至85%左右时予以传代。

1.3 转染 将20 μmol/L 的siRNA 8 μl 稀释于250 μl 无血清1640，轻轻混匀，室温孵育5 min。加入8 μl Lipofectamine 2000，室温孵育5min。将siRNA 稀释液与Lipofectamine 2000 稀释液混匀，总体积500 μl，室温孵育20min。转染前1d 将细胞接种于6 孔培养板。接种密度为1 ×105个/孔，使得次日转染时细胞融合达60%～70%。Western blot 检测沉默效果。

1.4 MTT 将转染成功的细胞和未转染细胞各5000 个种入96 孔板，于种板后的第2d 予以4 Gy X 线照射2 h，常规培养4d，MTT 法检测吸光值。

1.5 平板克隆形成实验 将转染成功的细胞和未转染细胞各500 个种入6 孔板，于种板后的第2d 予以4 Gy X 线照射2 h，常规培养10d，吸取培养基后予以甲醇固定，0.1% 结晶紫予以染色15 min，计数肉眼可见的克隆数，克隆形成率(%)=阳性克隆数/种板细胞数×100%。……