李文芳，陈佰鸿，毛 娟，马宗桓，杨世茂

（甘肃农业大学园艺学院，兰州730070）

doi：10.3969/j.issn.1672－5565.2015.03.03

葡萄BRX基因家族生物信息学分析

李文芳，陈佰鸿∗，毛 娟，马宗桓，杨世茂

（甘肃农业大学园艺学院，兰州730070）

BRX基因家族是一类植物特有的转录因子家族，在拟南芥中参与调节根细胞的增殖与伸长。利用生物信息学方法对葡萄基因组中存在的BRX基因家族进行了电子克隆，并对其进行了基因组的定位、蛋白质的结构、理化性质、二级结构及亚细胞定位的预测与分析，并对其与其它植物进化的亲缘关系进行了研究。基因组定位结果发现：葡萄基因组中6个BRX基因集中分布在3条染色体上，其中VvBRX1和VvBRX2分布在第2条染色体上，VvBRX3和VvBRX4分布在第9条染色体上，VvBRX5 和VvBRX6分布在第11条染色体上；编码蛋白的氨基酸数目为360～560个，VvBRX5的相对分子量（61 884.4）和理论等电点（9.38）均最大，而VvBRX1的相对分子量（40 239.1）和理论等电点（6.23）均最小。研究显示，不同成员间氨基酸数目、氨基酸序列间存在一定的差异，但都为疏水性蛋白；α－螺旋和无规则卷曲为6个BRX氨基酸序列的主要组成部分；均不存在跨膜域及信号肽。基因结构分析表明，6个BRX基因都含有外显子和内含子结构。亚细胞定位分析表明：6个VvBRX基因均定位于细胞核。系统进化分析结果表明，VvBRX1、VvBRX2基因与胡杨的亲缘关系最近，相似性达96％；VvBRX3、VvBRX4与蓖麻、麻疯树、柑橘、可可、大豆聚为一类，说明其进化关系较近；VvBRX5与其它VvBRX基因明显分开；VvBRX6基因与莲的亲缘关系最近。试验结果为葡萄BRX基因家族的克隆和功能分析奠定了一定的研究基础。

葡萄；BRX基因家族；生物信息学分析

转录因子（Transcription factor，TF）又称反式作用因子（Trans⁃acting factor），是一组能够与顺式作用元件（启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等）发生特异性结合，通过它们之间以及其它相关蛋白之间的相互作用，参与调节靶基因转录，并使之以特定的强度在特定的时间和空间表达的结合蛋白［1］。该蛋白的作用与细胞分化、多细胞生物的形态发育、器官的建成以及对外界刺激的反应密切相关。所有转录因子结构均含有两个结构域——一个是DNA结合域（DNA binding domain），用于识别和结合顺式作用元件的目标位点，另一个是转录激活域（Activatingdomain），用来组织其它参与激活转录的附加蛋白［2］。

BRX（Brevis Radix）基因家族属于一类新的植物特有的转录因子家族。刘佳（2008）对水稻BRX基因家族的研究发现，这个家族的基因不仅仅参与调控多个激素途径和根的发育，同时也很有可能是一类新的与植物非生物胁迫相关的转录因子。拟南芥中BRX是由自然变异形成的终止突变产生的新基因家族，主要通过控制油菜素内酯和生长素途径来调节根细胞的增殖与伸长［3］。拟南芥中包含5个BRX基因家族的同源基因，它们的蛋白序列均含有两个非常保守的BRX结构域，单个的BRX结构域是一个蛋白质相互作用的结构域，同时它也能在PRAF（PH，RCC1 and FYVE）家族找到。该BRX结构域行使着介导BRX和PRAF蛋白质家族在酵母（酿酒酵母）中的同型和异型相互作用的生物学功能，但是只有当两个BRX结构域同时存在时BRX功能才能正常运作［4］。拟南芥BRX家族的5个基因的同源性虽然非常高，但是，他们并没有冗余的生物学功能［4］。前人研究揭示，BRX基因的功能与细胞分裂素（Cytokinin，CTK）具有紧密的联系，BRX基因突变会导致主根的缩短，降低CTK对侧根抑制的敏感性［5］。BRX基因缺陷会导致油菜素内酯水平的下降，对主根的生长有很大影响，并且会间接影响到CTK条件下中柱鞘细胞对生长素的积累和响应，从而表现出侧根受抑不敏感的现象［6］。此外，有研究发现，中柱鞘细胞在侧根起始的第一次不均等分裂前就具有了局部生长素的积累和响应［5］。

葡萄（Vitis vinifera L.）归于葡萄科葡萄属，是起源最古老且是世界性重要果树之一，同时，也是继拟南芥、水稻和杨树后完成全基因测序的第4种开花植物，其基因组大小约为拟南芥基因组的3到4倍（约为500Mbp）［7］，具有较高的营养、食疗和经济价值，因此葡萄分子生物学的进一步研究将逐渐成为学术界研究的重点代表对象之一［8］。本研究拟采用生物信息学工具与分析方法，对NCBI数据库中已注册的，来自蓖麻、大豆、葡萄、高粱、黄瓜、拟南芥、杨树的BRX家族中各基因编码的氨基酸序列进行基因组信息的挖掘与分析，进一步推测该基因家族的分子生物学功能，对于植物的遗传改良及非生物逆境胁迫方面具有深远的意义。

1 材料和方法

1.1 葡萄BRX基因家族成员的检索

在NCBI（National center for biotechnology information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中通过blastp在线检索葡萄无冗余蛋白质数据库，再利用Translate tool（http://web.expasy.org/translate/）和ScanProsite tool（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）进行基因序列的翻译和预测候选蛋白的BRX结构域，若该蛋白上同时存在两个BRX结构域，则认为该候选蛋白属于BRX蛋白家族，若未能检测出同时存在的两个BRX结构域或只有一个BRX结构域，则认为其不属于该家族。在此基础上通过 BLAST Server（http://www.genoscope.cns.fr/cgi⁃bin/blast＿server/projet＿ML/blast⁃result.pl？ref＝dc34a3dd6f19ccaa693ad3f1b935f228）寻找其对应的cDNA登录号和 DNA序列，并将其定位于染色体上［9］。

1.2 葡萄BRX基因家族结构分析

根据检索得到的cDNA和 DNA序列，利用GSDS 2.0（Gene Structure Display Server）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在线预测葡萄BRX蛋白的内含子和外显子的组成［10］。

1.3 葡萄BRX基因家族的理化性质分析

使用 ProtParam［11］（http://expasy.org/tools/protparam.html）在线预测该蛋白家族的氨基酸理化性质（包括氨基酸数目、分子量、理论等电点、脂溶指数和不稳定指数）；蛋白二级结构预测利用 HNN SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD［12］程 序 （http://npsa⁃pbil.ibcp.fr/cgi⁃bin/npsa＿automat.pl？page＝/NPSA/npsa＿hnn.html）完成；TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM－2.0/）进行蛋白质跨膜域分析；SignalP 4.1 server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）完成信号肽的分析［13］；WoLF PSORT（http://www.genscript. com/psort/wolf＿psort.html）进行亚细胞定位分析［14］。

1.4 葡萄BRX基因家族系统进化树构建

把VvBRX1、VvBRX2、VvBRX3、VvBRX4、VvBRX5、VvBRX6基因的 CDS区以 FASTA格式分别提交NCBI在线比对，选择与其同源性较高的物种：川桑（Morus notabilis）：XM＿010112136.1、胡杨（Populus euphratica）：XM＿011029755.1、桃（Prunuspersica）：XM＿007210759.1、蓖麻（Ricinus communis）：XM＿002521302.1、柑橘（Citrus sinensis）：KK784904.1、可可（Theobroma cacao）：XM＿007024521.1、白梨（Bretschneideri）：XM＿009374097.1、莲（Nelumbo nucifera）：XM＿010263665.1、麻疯树 （Jatropha curcas）：XM＿012213513.1、大豆（Glycine max）：XM＿003528399.2，然后利用MEGA5.0和Clustalx软件构建系统发生树［15］。

2 结果与分析

2.1 葡萄BRX挖掘和基因定位及蛋白理化性质分析

经葡萄基因 Blast⁃search（http://www. genoscope.cns.fr/cgi⁃bin/blast＿server/projetML/blast.pl）对比检索，共得到6个候选的葡萄BRX氨基酸序列（见表1）。同时在 GenBank中搜索相应的cDNA登录号和DNA序列［16］，并进行染色体定位，结果表明6个葡萄BRX基因分布在3条（第2、9、11条）染色体上，分布的数量都为2个（见表1）。

葡萄BRX蛋白家族的氨基酸数目分析结果显示：它们的长度在360～560个氨基酸之间，其中VvBRX5所含氨基酸数目最多（560个），而VvBRX1最少（360个）；蛋白质的相对分子质量分析结果发现：VvBRX5的相对分子质量最大（61 884.4），而VvBRX1最小（40 239.1）；等电点的分析显示：VvBRX1预测的等电点最低（6.23），而VvBRX5最高（9.38）；脂溶指数（Aliphatic index）分析结果表明：6个葡萄BRX翻译蛋白的脂溶指数均小于100，说明它们都为疏水性蛋白，不稳定指数（Instability index）分析表明：6个蛋白质的稳定指数在45.52～57.66，归为稳定蛋白（见表1）。

表1 葡萄BRX挖掘和基因定位及蛋白理化性质分析Table 1 Grape BRX m ining and genemapping and analysis of protein physicochem ical properties

2.2 BRX基因家族的基因结构

葡萄BRX基因的结构分析表明，6个BRX基因均有内含子和外显子，在第2条染色体上的VvBRX1 和VvBRX2基因均有6个外显子和5个内含子；同在葡萄第9条染色体上的 VvBRX3和VvBRX4中有5个外显子，分别被4个内含子分开；同在第11条染色体上的VvBRX5和VvBRX6基因中均有4个外显子和3个内含子。且VvBRX1和VvBRX2、VvBRX3和VvBRX4、VvBRX5和VvBRX6基因有着非常一致的结构，相同位置的外显子和内含子的大小都相差无几，说明这些基因具有高度保守的结构域。（见图1）。

图1 BRX基因外显子/内含子组成分析Fig.1 Composition analysis of BRX gene exon/intron

2.3 葡萄BRX基因家族蛋白质结构预测分析及亚细胞定位

跨膜域的预测结果显示，葡萄6个BRX基因均不存在跨膜域，且无信号肽，因而可以推测为膜内蛋白。亚细胞定位分析显示：葡萄6个BRX基因均定位于细胞核（见表2）。

表2 葡萄BRX基因蛋白的亚细胞定位Table 2 Subcellular localization of grape BRX gene protein

2.4 BRX基因家族蛋白质二级结构对比分析

葡萄6个BRX蛋白的二级结构主要由α－螺旋、无规则卷曲和扩展链结构3种形式构成，其中，无规则卷曲＞α－螺旋＞扩展链结构（见表3）。

2.5 葡萄BRX基因家族氨基酸序列的同源性比较

葡萄BRX氨基酸序列的同源性比较结果发现（见图 2），所有 BRX氨基酸序列的同源性是60.35％，说明BRX基因家族的氨基酸序列同源性较高。所有BRX氨基酸序列两两比对发现，VvBRX3与VvBRX4的氨基酸序列同源性最高，高达97.84％。VvBRX1与VvBRX5的氨基酸序列同源性最低，低至49.91％。同在葡萄第2条染色体上的VvBRX1与VvBRX2的氨基酸序列同源性是81.22％，同在葡萄第9条染色体上的VvBRX3与VvBRX4的氨基酸序列同源性是 97.84％，同在葡萄第 11条染色体上的VvBRX5与VvBRX6的氨基酸序列同源性是64.64％。

表3 BRX基因蛋白二级结构对比分析Table 3 Com parative analysis of BRX gene protein secondary structure

2.6 BRX基因保守结构域的对比分析

保守结构域是蛋白质中能够折叠成特定三维结构的、在生物进化或者一个蛋白家族中具有不变或相同的一段局部保守区域，其结构亚单位称为模体（Motif），又称基序，组成这些模体（或基序）的氨基酸区段行使着特异的生物学功能，且不能被改变，并蕴含各自的遗传进化信息，通常决定一个基因家族［17］。葡萄6个BRX基因的中间段和末尾段都含有非常保守的两个长56 aa的 BRX结构域（见图3），从而构成了一个植物特异性转录因子大家族。这两个高度保守区应该是BRX基因主要功能的信息区，也是不同物种以及同一物种基因家族的同源性所在。

2.7 葡萄BRX基因的系统发生分析

系统发育树分析表明，葡萄的6个BRX基因可以明显分为两组，第11条染色体上的VvBRX5明显分开，说明其可能有其它功能；第9条染色体上的VvBRX3、VvBRX4与蓖麻、麻疯树、柑橘、可可、大豆聚为一类，说明其进化关系较近；第11条染色体上的VvBRX6基因与莲聚为一类；第2条染色体上的VvBRX1、VvBRX2基因与胡杨、川桑、桃聚为一类，其中与胡杨的亲缘关系最近，相似性达96％（见图4）。

图3 利用Scan Prosite对VvBRX进行保守域搜索的结果Fig.3 Scan Prosite use for VvBRX conservative domain search results

图4 植物来源的BRX基因序列系统发生树Fig.4 Phylogenetic tree based on the BRX gene sequence from plant

3 结论与讨论

植物转录因子的研究是功能基因组学研究的热点中的重点，也是生物科学的前沿领域之一。近年来，相继从高等植物中分离出一系列调控非生物逆境胁迫（干旱、低温及高盐）、激素、病原等因子应答反应及与生长发育、代谢相关的转录因子基因，这些转录因子可以减少这些非生物逆境对植物造成的伤害，提高植物对多种逆境的适应和抗逆能力［18］。因此，对相关基因的研究不仅可以阐明植物对环境胁迫信号的应答机制，还能为作物抗逆性分子育种提供基因资源和一定的理论基础，并有望进一步通过基因克隆技术来获得抗逆性强的转基因材料［19］。

葡萄是世界四大水果之一，它的根系在抗非生物逆境胁迫和提高产量等方面起着非常重要的作用。对葡萄中BRX基因家族进行多方面的分析鉴定，发现葡萄的BRX基因家族在根生长发育中起着非常重要的作用［20］，可能在葡萄的生长发育和抗逆中起着一定的调控作用。基因是染色体上具有控制生物性状的DNA片段［21］。6个蛋白都为疏水性蛋白，且6个基因之间有很高的相似性，都含有外显子和内含子，功能域分析发现每条基因所翻译的蛋白结构中都同时有两个BRX结构域，说明它们都能够表达，这与刘佳（2008）对水稻BRX基因家族的研究结果一致。

总的来说，转录因子的数量庞大，种类繁多，一个转录因子可参与调控多个基因的转录和表达，而一个基因的转录和表达又可受多个转录因子的的组合调控，从而形成复杂的调控网络。对生根相关BRX基因家族的研究任重而道远，相信随着实验技术和生物信息学的不断发展，以及对植物生根转录表达谱及相关BRX候选基因的深入了解，葡萄BRX基因家族与根生长的分子调控网络将会越来越清晰。此外，BRX基因家族除了与CTK作用于植物根系的生长外，对这个基因家族在应答非生物胁迫研究领域的生理与分子机制的进一步研究有助于我们更好地全面认识并完善植物逆境调控下的遗传网络系统。

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Bioinformatics analysis of the BRX gene family in grape

LIWenfang，CHEN Baihong∗，MAO Juan，MA Zonghuan，YANG Shimao
（College ofHorticulture，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

BRX gene family is a class of transcriptional factors that present only in plant，and it plays an important role in the regulation of cell proliferation and root elongation in Arabidopsis.With the approaches of bioinformatics，BRX gene family present in the grape genome was performed in silico cloning，genome localization，protein structure，physical and chemical characteristics，secondary structure as well as subcellular localization prediction and analysis.Moreover，the evolutionary relationships of BRX gene family derived from other plantswere predicted. Genomemapping results showed that：6 BRX genes in grape genome were located on 3 chromosomes，VvBRX1 and VvBRX2 in chromosome 2，VvBRX4 and VvBRX3 in chromosome 9，VvBRX6 and VvBRX5 in chromosome 11.The encoded proteins contain 360－560 amino acids，the relativemolecularweight（61 884.4）and the p Ivalue（9.38）of VvBRX5 were the maximum，while the relative molecular weight（40 239.1）and the pI value（6.23）of VvBRX1 were the minimum.The study suggested that there were some differences between the amino acid sequences of differentmembers，while they allwere hydrophobic proteins.The 6 BRX amino acid sequencesmainly contain alpha helix and random coil and did not have transmembrane domains and signal peptide.Gene structure analysis showed that the 6 BRX genes contained exons and introns structure.Subcellular localization analysis showed that six VvBRX genes are located in nucleus.Phylogenetic analysis showed that VvBRX1 and VvBRX2 had the closest relationship with populus euphratica，the homology was 96％.VvBRX3 and VvBRX4 were clustered a classwith Ricinus communis，Jatropha curcas，Citrus sinensis，Theobroma cacao and Glycine max，indicating that the evolutionary relationshipswere very closer.VvBRX5 was significantly separated from other VvBRX genes.VvBRX6 had the closest relationship with Nelumbo nucifera.These experimental results provide a significant foundation for further research on function analysis of the BRX gene family in grape genome.

Grapevine；BRX gene family；Bioinformatics analysis

S663.1；Q343.1

A

1672－5565（2015）03－158－07

2015－03－15；

2015－06－05.

甘肃省农牧厅农业科技创新项目（GNCX－2013－38）；甘肃省自然基金（1308RJYA062）；国家自然科学基金（31460500）。

李文芳，女，本科生，研究方向：果树生理与生物技术；E⁃mail：1304784689＠qq.com.

∗

陈佰鸿，男，教授，研究方向：果树生理与生物技术；E⁃mail：bhch＠gsau.edu.cn.